一文读懂利用生物膜干涉技术（BLI）进行竞争性结合实验

生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry，BLI）

生物膜干涉技术（BLI）采用探针式生物传感器对样品直接进行检测，对检测样品无需做任何荧光或同位素标记。通过仪器发射白光到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响并形成干涉。通过对分子结合过程的实时监测，系统会测定结合常数（ka 或 kon）和解离常数（kd 或 koff），以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力（KD）和浓度信息。

BLI技术原理

当分子与固定在生物传感器表面上的配体结合时，引起光学层的厚度增加，反射光的路径长度比之前更长。这导致干涉光谱曲线发生改变，并向右产生位移。当分子和配体解离时，分子会从生物传感器表面解离到溶液中，这将导致干涉光谱曲线向左移动。以干涉光谱曲线的偏移距离（以nm为单位）与反应发生时间绘制的关系图被称为传感图（Sensorgram）。通过传感图，可在各种结合模型的基础上拟合出ka，kd 和KD的数值。

研究多个分子间的竞争性结合是药物研发、信号转导途径研究中常用的实验手段，针对样品的性质不同，可以采用SPR（Biacore）、BLI、MST及ITC等技术研究分子间的竞争结合。抗体表位分组是研究抗体是否竞争性结合抗原的实验，是竞争性结合实验最常见的一种形式。下面以抗体表位分组为例，对竞争性实验做了一个详细的介绍。将表位分组中的两个抗体和一个抗原看作是其他不同的分子，有助于理解其它生物分子间的竞争性结合或者协同效应的分析。

表位分组三种方法

随机法（In-Tandem Assay）

用生物传感器捕获法固化抗原，再结合Ab1至饱和，然后在上样Ab2，Ab2能与抗原结合表明没有竞争，若Ab2不能与抗原结合则有竞争。要求一抗能够实现与抗原的饱和结合，一抗的浓度要求较高，适合于一抗解离慢的样品。如果一抗的解离较快，二抗中需要加入和前一步相同浓度的一抗。此方法可避免因抗原本身结构改变或者无序性导致的结合位点封闭以及重叠。

三明治法/双抗夹心法（Classical Sandwich Assay）

用生物传感器固化Ab1，再与抗原孵育结合，然后与Ab2进行结合检测。要求Ab1与抗原的结合牢固，解离慢。适用于粗样品或者纯化过的样品，但是要求抗原本身是单体。如果是多聚体样品，则有可能会出现假阳性的结果。

预混法（Premix Assay）

通常只适用于纯化的样品进行实验。首先将Ab1固化到生物传感器，然后结合已经预混好的Ab2和抗原，Ab2的摩尔浓度应为抗原的3-5倍以上，以确保几乎所有的抗原都被Ab2结合。这个方法不受抗原是否是多聚体的影响，是对其他两种实验方法非常好的验证或补充实验。

案例一：竞争性结合实验揭示疫苗加强针提升奥密克戎感染的重症保护分子机制

从多名三剂新冠疫苗接种者的新冠特异性记忆B淋巴细胞中成功获得323株全人源抗体，用Octet® RED384检测发现这些抗体都与野生型的新冠病毒S蛋白高亲和力结合，其中24株对奥密克戎等突变株均有比较强的抑制活性。这表明三剂疫苗免疫后，约7%的记忆B淋巴细胞携有广谱性中和抗体。从中选取了几株活性最高的广谱性抗体（比如编号347，265抗体），并对其与S蛋白的复合物进行了结构解析，发现了奥密克戎的抗体逃逸表位G446S。

将带His标签的S蛋白固化在NTA传感器上，分别与347和265抗体结合，发现347和265结合不同的表位（Octet® RED384）。

Memory B cell repertoire from triple vaccinees against diverse SARS-CoV-2 variants.Nature

案例二：竞争性结合实验筛选抗病毒活性抗体

Charles Rice和另外两位科学家发现了丙肝病毒而获得了2020年诺贝尔医学奖。2020年，在新冠病毒肆虐的形势下，他与洛克菲勒大学的同事在Nature杂志上联合发表了一篇文章，主要研究新冠患者个体在恢复期内的新冠病毒血清抗体反应。本文用生物层干涉技术做了抗体表位分组实验（竞争实验的一种）。

从COVID-19康复患者身上获得的大多数恢复血浆并不具有高水平的病毒中和活性。NT50（50%最大病毒中和效价）与症状的持续时间以及症状严重程度相关，而结合RBD（S蛋白的受体结合结构域）和S蛋白的IgG抗体的水平与NT50密切相关。科研人员从康复病人的血液中分离出与S蛋白RBD结构域相结合的B细胞，并对其表达的抗体进行克隆表达，发现了具有强大抗病毒活性的RBD特异性抗体（编号为C144、C101、C121、C009、C135）。应用Octet系统进行表位分组实验，发现这些抗体可以识别不同的RBD表位。这些实验表明针对S蛋白RBD结构域的疫苗应该具有很好的保护作用，为今后的疫苗设计指明了方向。

案例三：竞争结合实验助力揭示艰难梭菌毒素入侵人体的机制

2022年，西湖大学生命科学学院陶亮团队等在《细胞》（Cell）杂志上在线发表题为“TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile”的研究论文，首次报道了组织因子途径抑制物（TFPI）是超毒力艰难梭菌TcdB在宿主中的病理相关受体，并用冷冻电镜方法解析了毒素与受体结合的复合物结构。艰难梭菌是一种厌氧的革兰氏阳性细菌，会导致抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎等疾病，其中一个分支会分泌TcdB2，TcdB4毒素。目前，这些毒素在小肠上皮的受体并不明确。西湖大学陶亮组用CRISPR/Cas9的基因敲除文库筛选技术发现了组织因子途径抑制因子（TFPI）是这些毒素的受体，并解析了TFPI/ TcdB4复合物结构。用Octet®检测了两者之间的亲和力，同时动力学实验表明，TcdB4与FXa均可与TFPI的同一loop结合，相互之间是竞争关系。这与前人的研究以及结构学是完全一致的。这项研究对于揭示和理解艰难梭菌感染的致病机制，与为超毒力分支菌株引起的艰难梭菌的感染预防和治疗新方法的开发提供了重要的理论依据。

用Octet® RED96e和Anti-human Fc传感器固化Fc融合TFPI，与TcdB4结合的亲和力（KD值）达到nM级别。

Octet®固定TFPI，先结合TcdB4后，FXa的结合信号显著下降（左图）。反过来亦是如此（右图）。即FXa与TcdB4相互阻断。

Bio-layer interferometry assays

The binding affinities between recombinant TcdB4 and human/mouse TFPI domains were measured by BLI assay using the Octet RED96 system (ForteBio). All proteins were diluted in PBS. In brief, Fc-tagged human/mouse TFPI domains (10 μg/mL) were immobilized onto Dip and Read Anti-Human IgG-Fc biosensors (ForteBio) and balanced with PBS. The biosensors were then exposed to full-length TcdB4, TcdB41285-1834, or TcdB21285-1834, followed by washing (dissociation) with PBS.

Binding affinities (Kd) were calculated using the Data Analysis software (ForteBio).To analyze sequential bindings of FXa and TcdB4 to TFPI, TFPIK2-Fc (10 μg /mL) was immobilized onto Dip and Read Anti-Human IgG-Fc biosensors and balanced with HNBSACa buffer (50mM HEPES, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.3). The loaded biosensors were first exposed to 100 nM FXa, balanced again with HNBSACa, and then exposed to 300 nM TcdB41285-1834. Alternatively, the loaded biosensors were first exposed to 300 nM TcdB41285-1834, balanced with HNBSACa, and then exposed to 100 nM FXa. All biosensors were then washed with HNBSACa.

TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile.Cell