生物信息学100个基础问题 —— 第36题 RNA-Seq 数据的定量基本假设以及TPM

北京大学生物学博士

Hello 大家好！

书接上回，生物信息学100个基础问题 —— 第35题 RNA-Seq 数据的定量之RPKM和FPKM ，我们在BBQ35中为大家介绍了RPKM和FPKM的原理以及计算方法，我们也说FPKM/RPKM有一个比较明显的缺点，就是不能够保证不同样本之间FPKM的总和是一个定值。因此才会引出我们今天的介绍内容TPM。

1. TPM的介绍

TPM = Transcripts Per Million，简单来说就是为了解决FPKM 总和不一致的情况。具体计算的方法如下：

1. 先计算每一个gene的FPKM
2. 计算所有gene的FPKM总和sum(FPKM)
3. 最终gene的TPM = gene的FPKM / sum(FPKM) * 10^6

再简单一点说明，gene的TPM就是其FPKM百分数再乘以10^6，因此一个样本的TPM的总和一定是10^6. 这样做的好处就是能够把所有样本的TPM总和统一，都变成10^6。目前很多公共数据的数据都是以TPM的方式提供，比如非常著名的GTEx数据库，提供了超过10000个人组织RNA-Seq的测序表达量矩阵，其中的表达量定量方式就选择了TPM。

图1 GTEx项目主页（https://gtexportal.org/home/）

2. RPKM/FPKM/TPM什么情况下会定量失败？

说了半天，其实大家一定要先搞明白一个问题，无论是RPKM还是FPKM，亦或是TPM，本质上都是gene 表达水平的相对定量结果。

这个结论非常重要！！！这个结论非常重要！！！这个结论非常重要！！！

也正是因为RNA-Seq的相对定量结果，会有2种情况导致RNA-Seq定量失败；

2.1 第1种情况：gene表达量发生普遍变化。

我给大家举一个非常简单的例子，比如我有两个样本分别叫做A和B，其中B的每一个gene表达量都只有对应样本A中的gene表达量的一半，那么结果就是如果使用RNA-Seq对这两个样本进行定量，那么定量的结果会是一样的，也就是两者计算的RPKM/FPKM/TPM会是一样的。

通过上面的例子，我们可以作出一些推论：当两个样品中的绝大多数gene都发生相同方向的倍增或者倍减关系的时候，RNA-Seq会定量失效。这个非常重要！比如在很多癌症样本与正常组织样本的比较中，癌症样本很多时候会出现很多gene的普遍升高或者普遍降低，这个时候就需要其他特殊的办法来解决这样的问题，具体的方法后面我们会介绍。不过这种现象一般比较少见，几种常见需要考虑这个问题的情况：某些特殊表达细胞体系；很多癌症的miRNA-Seq 等。

2.2 第2种情况，超高表达量的gene表达量发生变化

思考一下这种情况：有两类细胞，分别是cell1和cell2，真实的情况是geneA本身是一个表达量很高的gene，同时在cell2中，geneA的表达量继续升高数倍，同时其他gene的表达量几乎不变。这个时候我们对这两种情况进行RNA-Seq建库测序，结果就会是发现其他gene普遍下调，而不仅仅是geneA的上调。如图3所示，最后建库的时候，会测到非常多的geneA的reads，其他gene的reads就会相对减少，所以会造成其他gene RPKM/FPKM/TPM下降的假象。