如何读懂FastQC报告的duplicate模块
参考Revisiting the FastQC read duplication report以及A new way to look at duplication in FastQC v0.11。我之前一直不太明白duplicate模块，今天看了这两个帖子，感觉一下子就明白了，下面用自己的语言翻译一下，加深自己的理解，也希望能帮助到一些需要的人。
在FastQC报告中，duplicate模块有两条折线（如图1），蓝线代表总reads的重复情况，红色线代表Deduplicated reads的重复情况。这里的deduplicated reads并不是代表只出现一次的reads，它是代表所有不同的reads。比如说有20条reads，其中有10条出现1次，有5条分别出现2次，这里有15条reads是各不相同的，则total reads为20，deduplicated reads为15。因此deduplicated reads可以认为是出现1次的reads的数目+出现2次的reads的数目+出现3次的reads的数目+...(以此类推)。
图1的表头的deduplicated percentage=deduplicated reads/total reads * 100%。下面的蓝色折线的意思是：total reads中出现1次，2次，3次...的reads分别占total reads的比例；红色折线的意思是：deduplicated reads中出现1次，2次，3次...的reads分别占deduplicated reads的比例。
图1
下面以两个简单的例子也说明如何计算：
例子1：有20条reads，10条出现1次，5条出现2次，其生成的图如图2上面截图所示。此时Total reads=20，deduplicated reads=10+5=15，deduplicated percentage= 15/20=75%；当出现次数为1时，%total reads=10/20=50%，%deplicated sequences=10/15=66%；当出现次数为2时，%total sequences=10/20=50%；%deplicated sequences=5/15=33%。计算结果跟图2上面的截图展示一致。
例子2：有20条reads，10条出现1次，1条出现10次，其生产的图如图2下面截图所示。此时Total reads=20，deduplicated reads=10+5=11，deduplicated percentage=11/20=55%；当出现次数为1时，%total sequences=10/20=50%，%deplicated sequences=10/11= 91%；当出现次数为10时，%total sequences=10/20=50%，%deplicated sequences=1/11=9%。计算结果跟图2下面的截图展示一致。
图2
如何根据deuplicated图来查看数据的重复情况呢？下面给出三个例子的说明：
例子1：从图3表头可以看到该数据的deduplicated percentage=95.09%，说明重复率特别低。观察蓝色和红色折线发现两者几乎重叠，而且有95%以上reads只出现1次，低于5%的reads重复数目大于10。总体而言，该数据重复度特别低。
图3
例子2：图4是一个RNA-seq数据的评估结果。从图中知道该数据的deduplicated reads=49.38%，即有一半可能存在重复。但在RNA-seq数据中，可能存在某些转录本较短，表达水平很高，导致在随机打断后被重复抽到测序的概率大大增加。因此对于RNA-seq数据来说，重复性较高的序列不一定就是PCR重复。紧接着，观察两条折线知道，大部分序列的重复性在2-9次，它们极可能覆盖了一些“normal”基因；部分序列的重复性在10-100次，它们可能覆盖在rRNA或一些重复序列上；只有极少数序列的重复度超过100。因此，总体而言，该RNA-Seq数据可以代表一个多样性较丰富的文库。
图4
例子3：图5则代表有高度的重复。首先该数据的deduplicated reads非常低，观察折线发现当出现次数为1时，%Deduplicated sequences高达80%，而%Total sequences则低于10%；当出现次数大于1k时，%Deduplicated sequences在1%左右，而%Total sequences则在20%以上。这些数据说明了有极少数序列重复出现了上1千次，导致整个文库的重复率特别高，这少数部分的序列应该是PCR重复。
图5
FastQC deduplicated模块大致的内容就这些，有兴趣可以自己写代码实现，测试一下自己的脚本画出来的图是否与FastQC的结果一致。