日常瞎掰

  通过标题大家已经知道今天我们分享的主要内容了。DoHeatmap这个函数来自于Seurat包，处理过单细胞的人应该都知道这个函数的功能就是用来画每个cluster中marker基因的热图。虽然这个函数用起来很省事，但还是有需要注意的地方。那么，用这个函数的时候需要注意哪些关键的点呢？不要认为任何一个数据都可以一键处理得到结果，也许咱们的结果会遗漏了重要的信息，也许咱们就无法画出热图。不要问我是怎么知道的！下面我就来分享一下踩坑后知道的两个点：
  1、首先搞清楚做热图前ScaleData时用的基因数量；
  2、细胞数量是不是超过30k。
  为什么要搞清楚ScaleData时用的基因数量呢？我们都知道Seurat中函数都有默认的参数，比如默认FindVariableFeatures不设定基因数时默认是前个高变基因。而ScaleData默认使用的基因是FindVariableFeatures找出来的基因，这样一来如果ScaleData函数也没有指定哪些基因，那么该函数用的也就是前2000个高变基因。关键来了，由于DoHeatmap画图时用的数据是ScaleData后的数据集，而FindAllMarkers用的数据集是NormalizeData后的数据集，这时就会造成DoHeatmap画热图用的是前2000个高变基因中的marker基因，不在前2000个高变基因中的marker是不会出现在热图中的！
  为什么要注意细胞量是不是超过30k？这是因为超过30k细胞集有可能由于数据集过大而导致画不出热图，这个时候我们可以采取随机取样的方式将细胞数量downsample到30k以下，这样操作一番基本就可以正常出图了。

代码演练

  例如有一个Seurat的对象包含69000个细胞和36615个基因，这里仅为了说明如何避免以上两点可能带来的坑，示例代码不是很完整：

>library(Seurat)
>library(dplyr)

>sceagg
An object of class Seurat 
36615 features across 69000 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (36615 features, 0 variable features)

# 给所有基因都做一下scale
>sceagg <- ScaleData(object = sceagg, features = rownames(sceagg))

# 每个cluster选取300个细胞来画热图
>all.markers %>%
    group_by(cluster) %>%
    top_n(n = 10, wt = avg_log2FC) -> top10
>set.seed(42)
>subobj <- subset(sceagg, downsample = 300)
>options(repr.plot.width = 13, repr.plot.height=13)
>DoHeatmap(subobj, features = top10$gene, disp.min=-2.5, disp.max=2.5)

结果如下图：

  以上操作我们将所有基因都做了一下scale，以免绘制热图时可能遗漏marker基因，并且数据集含有69000个细胞，由于细胞数过大直接画DoHeatmap没法出图，所以这里我们每个cluster选取300个细胞来做热图。

结束语

  每当使用Seurat包的时候，心里都不由的感叹！开发这个包的那些人真的很厉害，可以让Seurat包用起来这么友好。虽然Seurat包用来处理单细胞很好用，但还是有很多细节有时候需要特别的注意，不然有可能会错过一些信息。

--------- The  End ---------

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