FPKM / RPKM与TPM哪个用来筛选差异表达基因更准确？你可别逗了！
最近网络上充斥着关于FPKM / RPKM与TPM的帖子，显然TPM越来越流行了，但很多测序公司的分析团队还没反应过来，仍然在麻木地把FPKM提供给客户。所以弄得很多小伙伴内心十分纠结，它们差异有多大？公司给我的是FPKM，对差异基因筛选有没有影响？
呵呵，今天你来对了，本文专治各种纠结！
1. RPKM / FPKM与TPM的差异
前文已经说了，这个问题搜一把可以搜出一大把，我就不说了。
但，你可能比我还懒，我还是简单贴一下概念吧！
RPKM：Reads PerKilobase Per Million Reads
FPKM：Fragments Per Kilobase Per Million Reads
TPM：Transcripts Per Million Reads
可以看出，RPKM与FPKM根本就是一回事，只是前者用的是单端测序（所以称为Read），后者用的是双端测序（双端测的是同一Fragment）。但现在基本上全是双端测序了，所以RPKM早已辉煌不在了。
TPM并不是最近出来的，只不过流行的比较慢，但最近越来越多的分析人员开始接受它，许多分析软件里的新星也都选择了它。
为什么？这当然是有原因的！
因为，TPM更好！
有一个重要指标可以很好说明这个问题：FPKM的创造者Pachter已经更倾向于使用TPM了！
在同一个样本内，无论是用FPKM还是TPM都是一样的，它们的相关性是1，TPM对总的测序reads进一步做了均一化，所以它们的最直观的差别就是，不同样本间TPM的总和是相同的，而FPKM的总和不同！可以想象，TPM使得我们更容易去比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。
哦！TPM更好？那我更纠结了！公司只给了我FPKM啊，这对差异基因筛选有没有影响？我筛选出的差异基因很少是不是和这个有关？
2. 主流差异表达分析软件从来不用TPM作为输入
鉴于TPM的流行势头，下文方中仅以TPM代表所有RPKM / FPKM或TPM等此类均一化表达数据。
大部分差异表达分析软件并不支持使用TPM进行差异表达基因筛选（当然也有极少数不推荐的软件例外，如Tuxedo），最主流的DE（differential expression）分析软件DESeq2 和 edgeR ，包括我强烈向大家推荐的sleuth包，都强调输入数据为：Raw read counts (not normalized) !
为什么说它们是最主流的？并且我也只推荐这几种工具（推荐顺序sleuth > DESeq2 > edgeR），是因为它们经受了更多的测试，并且也是引用人数最多的，空口无凭，当然有引文数据为证：
3. 用TPM的进行差异表达分析不是不好，是不可以！
那么为什么DE分析工具不用TPM呢？
首先，是没必要。不同样本间同一基因是否存在表达差异跟基因长短没有关系！简单化一点，假如AB两个样本测序特征相同（实际数据当然要经过一系列校正），那么无论某基因是1kb还是10kb，只要这个基因在A样本中map到的reads比B样本多，那么该基因在A样本中表达量就比B样品高，根本不需要考虑基因长度!
其次，是不能。因为差异表达分析软件要做的是多样本间同一特征比较前的均一化，而获得TPM时做的是样本内所有特征的均一化，两者目标不同，方法当然也不同，因此，如果用TPM等均一化后的数据进行差异表达分析不仅仅是画蛇添足，也不仅仅是丢失一些信息，它的后果很严重。
拿我自己的数据举个例子：两个样本，一个对照组，一个处理组，每组6个生物学重复，分别用Raw read counts与TPM做为输入，利用DESeq2进行差异表达分析（因为edgeR 通常筛选到的差异基因要少很多，而sleuth要输入其它数据，所以利用DESeq2简单作个例子），筛选标准为“log2FC > 0.5，padj < 0.05”，结果如下：
是不是很惊喜，是不是很意外？
用TPM只筛选到了不到4%的差异基因，但想一想，这还是很容易理解的，做完均一化，TPM在数值上变小了，样本间的差异也被缩小了，再做一遍校正，差异就没了，你用EXCEL算出来都比这多(但仍然不建议这么做)。
4. TPM，要你何用？
无论公司给你的结果用的是TPM还是FPKM，都不影响你的差异表达基因集，真正影响它的是差异分析软件！（提醒一下，不同软件，差异可能很大哦！）
估计有同学想拍桌子了，我做转录组就是来筛选差异表达基因的，既然你连这个都做不了，那还要你TPM干什么？
因为TPM是对样本内所有基因进行了均一化的，所以如果你想知道一个样本内A基因与B基因哪一个表达量高？或者A基因在这个样本所有mRNA中所点的比例等此类事情，TPM是个绝对必要的选择。实际上，除了差异表达基因筛选，后续的PCA、聚类分析、共表达分析、热图等都要用TPM。
TPM并不是万能的，如果两种组织中mRNA的总量本来就差得很多，怎么办？所以，参数的好坏关键要看用得合不合适。
所以，皇上，不是臣妾分内之事，臣妾做不到啊！
可能有同学会问：那我不用差异表达软件，我能不能利用TPM进行方差分析，筛选差异基因？这个工作用EXCEL就能完成，还开发啥软件啊？
答案当然是否定的！
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