单细胞分析流程之Cell Ranger结果解读

结果目录"outs"

首先我们看一下outs目录下的文件结构，如下图：

这些结果中主要分成了两部分：1. 集群中可以使用的结果（具体的内容可以参考上期文章“单细胞分析流程之Cell Ranger”）；2. 网页版报告。

本期的重点是解读网页报告中的内容。

"Summary"

1. 异常结果警告

如果数据中存在异常情况，网页的上面会出现黄色的警告信息。小编这次跑的结果完全正常，所以找了一下之前遇到警告信息，如下图：

当然如果这些报错信息并不影响结果，我们是可以用这个结果继续往后分析的～

2. 细胞和基因数的统计

随后就是查看这次分析中捕获到的细胞数以及基因数的情况，从这里就能大概知道数据的情况。

小编也做过好多10X的数据，一般捕获的细胞数都是5,000-10,000，平均的基因数大概是1,200-15,00，大家可以看看自己的数据是否也在这些范围内。如果这些值都是在可接受的范围，那么就可以进入下一步的分析啦~

3. 细胞的选取

随后就是细胞的选取了（也是一个相当重要的图），帮助我们更加直观的筛选细胞（如下图）

先我们先来看一下上方的折线图怎么看：

    Y轴是每个细胞中UMI的值，X轴是单个细胞的按照UMI大小的排序（降序），所以这个图中的曲线是下降的趋势。蓝色的线是选取的细胞（和2. 细胞和基因数的统计中的细胞数是一致的），灰色的线是背景。

正常的数据来说会有两个下降的趋势（如下图），第1个下降的趋势：区分完整细胞和背景物质（因为细胞和其他物质相比，真正细胞中会有更多的UMI，而其他物质可能没有或者由于一些污染能捕获到少量的转录本，所以会出现第一个下降的趋势）；第2个下降的趋势：区分细胞的质量，捕获率低或细胞破碎（这类细胞中基因数会很少，导致UMI数也少），而正常的细胞中UMI多且分布比较接近，所以质量好和不好的细胞在UMI上也会存在很大的差异，随后就出现了第2个下降趋势。

当数据出现了这两个下降趋势，且在蓝色区域的线条比较平稳时，也能说明我们的数据质量好~

4. 测序结果统计

继续往下走，下一部分是测序的信息，包括总的reads数目以及一些质控的指标，一般情况下Q30>90%表明质量是相当不错的。

当我们看数据的时候，如果遇到一些指标不太明白是什么意思，大家可以点击左上角的？，随后会列出下列指标的解释。

5. 比对结果统计

报告中除了会给出测序信息以外，也会给出与基因组的比对信息，主要包括Genome、Intergenic、Intronic、 Exonic、Transcriptome、Antisense to Gene（见下图）。

虽然测序和比对结果都是一些常规的质控信息，当我们数据一切正常的时候，看这些指标可能没有那么重要，但是一旦我们的数据比较奇怪的时候，例如发现检测到的细胞数还行，但是基因数特别少，这个时候测序和比对结果就相当重要了！小编之前遇到一个数据就是检测到的基因数特别少，然后聚类的时候就结果很差，后来就返回去看这些质控信息，惊奇的发现很多reads都是比对到了基因间区！ 所以测序的reads根本就没有落在基因上，导致了最终每个细胞检测到的基因非常少，然后再去继续往下找原因。所以呀，还是得多看数据，从那以后，数据下来小编都会先看看这些质控信息是否正常，才会继续往后做（质控也是做科研非常重要的一步呀~）

6. 样本信息

最后一部分就是样本信息啦（如下图）~

这一部分就是在运行Cell Ranger时候的参数信息，例如样本名、Chemistry（运行Cell Ranger时候我们没有设置这个参数，那么就默认选择auto：自动配置，在报告中会给出具体的类型，这个就是3' V3版本）、Reference以及Reference路径等等。这些信息的给出方便后面查找信息。

"Analysis"

介绍完Summary之后，下面就是Analysis.

1. 分群结果

左图：在TNSE中映射每个细胞UMI的值；右图：TSNE中分群的情况。

Cell Ranger做完定量之后呢，会默认拿已有的结果跑一下基本的分群，所以在看报告的时候我们也可以看一下这里的分群结果，心里大概有个数~