DNA甲基化研究方法速递

DNA甲基化在维持细胞正常功能、传递基因组印记，胚胎发育、肿瘤发生等方面发挥重要作用，目前已经成为表观遗传学和表观基因组学的研究热点。针对不同的研究目的，基于高通量测序的甲基化研究方法也是日新月异，色彩缤纷，难免使人眼花缭乱，今日小编带你简要领略一下他们的不同之处。

DNA甲基化是一种被广泛研究的表观遗传修饰方式，与组蛋白修饰等方式一起，在调控基因表达和染色质构象等方面发挥了重要作用。通常地，甲基化DNA指5-甲基胞嘧啶（5mC），它是在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下将甲基基团添加到胞嘧啶的5’C位置上形成的。由于基因序列没有改变，常规的测序无法准确测出甲基化的相关信息，需要借助于特殊的方法。

WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequence）全基因组甲基化测序，利用重亚硫酸氢盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后通过PCR将U变为A，仅有甲基化的C可以成功保留，最后通过测序就可判断CpG位点是否发生甲基化。

特点：精确度高、重复性好，最大的特点是检测范围广，可以覆盖全基因组范围内的每一个C碱基的甲基化状态；但是该方法需要的数据量比较大，成本较高。

图1  全基因组甲基化建库流程图

scWGBS（single-cell whole genome bisulfite sequencing）单细胞全基因组甲基化测序，是基于单细胞水平的全基因组 DNA分析。scWGBS 先进行细胞的分选裂解并进行 BS 转化，然后使用 Oligo1（含有接头和9个随机序列）扩增5个循环（step 2），然后进行富集；用同样的方法引入另外一端的接头（step 3），然后进行 PCR 扩增，上机测序。

特点：能够精确解析单细胞中每一个胞嘧啶的甲基化状态。

图2  单细胞全基因组甲基化建库流程图

RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing），简化表观亚硫酸氢盐测序，是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，大量提高CpG区域。酶切之后进行末端修复，连接接头，选择CpG富集的DNA片段用亚硫酸氢盐处理，然后进行PCR扩增。

特点：与全基因组甲基化测序相比，测序量大大减少。同时，利用RRBS可以实现多个样本的比对基因组分析；但是酶切位点有限，且酶切效率低均导致信息不全面。

图3  简化表观亚硫酸氢盐建库流程图

MeDIP（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing） 甲基化 DNA 免疫共沉淀测序，先通过与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中，富集胞嘧啶甲基化的基因组片断，然后对富集的片段进行高通量测序。

特点：检测范围覆盖全基因组，所需测序数据量较少，可广泛用于大样本量的疾病研究和分子育种研究；该方法仅能测定片段中的 DNA 甲基化情况，但是不能在单碱基分辨率水平上检测 DNA 胞嘧啶甲基化状态。使用抗体有非特异性结合的风险，最后得到的结果可能不是你想要的。

图4  甲基化DNA 免疫共沉淀测序建库流程图

RRHP（Reduced Representation 5-Hydroxymethylcytosine Profiling）DNA 羟甲基化，即 DNA 甲基化中的5-甲基胞嘧啶易发生氧化形成5-羟甲基胞嘧啶。Msp I 酶切完之后，末端修复，加上接头，然后 β-GT 反应将 5hmC 进行糖基化保护，无法被 Msp I 酶识别；然后进行再次酶切，与常规的 C 以及 5mC 相连的 P5 接头均被切下来，最后仅有含 5hmC 的片段含有两端接头，可以被扩增后建库测序。

特点：即可以检测基因组中的 5hmC 总量有可以测定特定序列中 5hmC 情况，但是仅限于酶切位点，应用有局限性。

图5  DNA羟甲基化建库流程图

oxBS-Seq（oxidativ ebisulfite sequencing）化学氧化结合重亚硫酸盐测序，在哺乳动物中，5mC 可以在TET酶的作用下转换成 5hmC，而传统的 WGBS 方法不能区分 5mC 和 5hmC。oxBS-Seq 技术先将 5hmC 氧化为甲酰基修饰（5fC），进而被重亚硫酸盐处理转换为U，从而排除了 5hmC 的干扰，实现 DNA 甲基化的精准检测。

特点：该方法为首个以单碱基分辨率对 5hmC 进行定量测序的方法，可以准确定位 5hmC 和 5mC 的位置，但是氧化反应的控制需要特别注意。

图6  化学氧化结合重亚硫酸盐流程图

以上就是常规的6种 DNA 甲基化研究方法，此外还有 MBD-seq、Target-BS 等等，不同的方法都有自己的适用性和局限性，期待更完善的研究方法应运而生！

参考文献

[1] Chromosome-wide and promoter-specific analyse sidentify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat. Genet. 2005.

[2] Quantitative Sequencing of 5-Methyl-cytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution. Sciencexpress, 2012.

[3] RRHP a tag-based approach for 5-hydroxymethylcytosine mapping at single-site resolution. Genome Biology, 2014.

[4] Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods, 2014.

建库测序业务线   何聪聪丨文案

王    迪丨编辑

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