1977年Sanger等发明双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法。

Sanger测序原理

由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，得到片段大小不一致的DNA混合物，然后通过凝胶电泳分离和放射自显影后识别确定待测分子的DNA序列。

特点：读长长（1000 bp），准确性高（99.999%），通量低。

随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing）应运而生。

代表有Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和Life technologies（ABI）公司的SOLiD技术；Life technologies公司的Ion Torrent和Ion Proton技术等，经过不断的竞争，454、SOLiD 和Helicos平台不再开发新的仪器，Illumina平台最终成为市场主流，其方法为边合成边测序。

边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）

在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

操作流程：

1.DNA文库构建

将基因组DNA随机片段化，然后通过末端修复、磷酸化、加A等步骤修补成平末端，最后加上特定的接头（Adaptor），构建成DNA文库。

2.簇的生成——桥式PCR

测序芯片实物图

（Flowcell ：流动池，就是一张芯片，如Hiseq2500有2张flowcell，即一次运行的测序量；Lane：每张flowcell上通常都有多个通道，每个通道可以单独测不同的样品。）

Flowcel上面连有两种接头（P5、P7），当DNA经变性后流经Flowcell时，利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。DNA进行桥式PCR扩增，从而将碱基信号放大。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

3.测序

4.数据产出

特点：通量高、时间短、读长短。

单分子测序技术原理

SMRT技术：

也采用边合成边测序方法，以SMRT芯片为测序载体，芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在碱基配对阶段，加入不同碱基会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。另外，若碱基存在修饰，则通过聚合酶的速度会减慢，因此可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间、两峰之间的距离来检测甲基化等碱基修饰情况。SMRT测序速度快（每秒约数个dNTP），但是，测序错误率也较高（达到15%，可通过多次测序进行有效的纠错）。

特点：无需PCR扩增，读长长，无视GC含量的影响

纳米孔单分子测序技术：

纳米孔测序理论自1989年被提出以来，历经近三十年的发展，终于从理论到商业化并得到越来越广泛地应用。该技术的原理是当在膜两侧施加电压，分子马达驱动DNA分子通过纳米孔，导致电荷发生变化，每种碱基引起的电流变化是不同的，通过检测这些电流进而转化为对应的碱基序列。

2017年国际顶级期刊《Nature》上发表了题为“DNA sequencing at 40: past, present and future”的综述文章（doi:10.1038/nature24286），用以纪念DNA测序四十周年，讲述了DNA测序技术的发展历程、当前应用和未来的发展。感兴趣的小伙伴可自行下载阅读。

DNA序列表征

A =腺嘌呤           

C =胞嘧啶            

G =鸟嘌呤             

T =胸腺嘧啶           

U =尿嘧啶

R = GA（嘌呤）        

Y = TC（嘧啶）    

K = GT（酮）    

M = AC（氨基）

S = GC

W = AT

B = GTC

D = GAT

H = ACT

V = GCA

N = AGCT（任何）

Fastq格式：一种基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式,一般都包含有4行。

第一行：由‘@’开始，后面跟着序列ID和可选的描述，序列ID是唯一的；

第二行：碱基序列；

第三行：由‘+’开始，后面是序列的描述信息；

第四行：第二行序列的质量评价(quality value)。

举例：

@HISEQ:777:HCMCVBCX2:1:1101:4712:2186 1:N:0:TACTCCAG

HISEQ：仪器 ID

777：Run ID

HCMCVBCX2：FlowCell ID

1：The lane number

1101：流通池道内的tile号码

4712：瓦片中的集群的‘x'坐标

2186：瓦片中的集群的’y'坐标

1：成对的成员，1或2（配对结束或配对读取）

N：如果读取过滤，则为Y；否则为N

0：当没有控制位开启时为0，否则为偶数

TACTCCAG：索引序列

Fasta格式：

1：以“>”为开头，fasta格式标志。

2：序列ID号，gi号，NCBI数据库的标识符，具有唯一性。

格式为：gi|gi号|来源标志|序列标志（接收号、名称等），若某项缺失可以留空，“|”保留。

3：序列描述。

4：碱基序列，序列中允许空格、换行、空行，一般一行60个。

Fastq文件→Fasta文件

Linux命令

法1：sed '/^@/!d;s//>/;N' your.fastq > your.fasta

法2：seqtk seq -A input.fastq  > output.fasta

FASTX-Toolkit

•一款用于处理Short-Reads FASTA/FASTQ文件的程序，里面包含了丰富的Fasta/Fastq文件格式转换、统计等命令。

http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/

GenBank格式

以LOCUS和一些注释行开始。

序列的开头以“ORIGIN”标记，末尾以“//”标记。

EMBL格式

以标识符行（ID）开头，后面跟着更多注释行。

序列的开头以“SQ”开头标记，序末尾以“//”标记。

表 1   GenBank & EMBL数据库格式的对比

EMBL → Fasta格式转换（在线工具）：

http://www.geneinfinity.org/sms/sms_embltofasta.html

另外给大家介绍一个常见测序文件格式解析的网站：

https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format1 

该网站包含了各种各样的测序文件格式说明，想了解文件格式各行各列的含义直接找它即可！点击下方“阅读全文”即可进入。

文案|张家常

编辑|吴子环、姚晓韵