做过1000遍RNA-seq的老司机告诉你如何翻车
熟悉我的人都知道RNA-seq是我的拿手好戏（如果你不熟悉我，今天过后请记住）。
但是我今天处理了一个公共数据，比对率低的惊人。
究竟为什么会发生这种小概率事情呢？
是测序数据质量不好？
难道grcm38与mm10有差别？
比对工具的默认参数不行？
这篇文章告诉你，老司机如我，也有翻车的时候。
数据比较新，所以理所当然的认为测序数据肯定是OK的。
数据下载地址
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE81916
下载sra数据，转换为fastq的过程我就不讲解了！(请翻看我以前的文章)
(17)一个ChIP-seq实战-生信菜鸟团博客2周年精选文章集
(18)一个mRNA-seq实战-生信菜鸟团博客2周年精选文章集
(19)一个affymetrix表达芯片实战-生信菜鸟团博客2周年精选文章集
总之，这次处理了GEO里面的4个公共数据，数据量如下：
Written 30468155 spots for SRR3589959.sra
Written 52972617 spots for SRR3589960.sra
Written 36763726 spots for SRR3589961.sra
Written 43802631 spots for SRR3589962.sra
我用的是hisat2工具来比对，一般情况下就用默认参数。
reference=/home/jianmingzeng/reference/index/hisat/grcm38/genome
~/biosoft/HISAT/current/hisat2 -p 5 -x $reference -U SRR3589959.fastq -S control1.sam 2>control1.log
~/biosoft/HISAT/current/hisat2 -p 5 -x $reference -U SRR3589960.fastq -S control2.sam 2>control2.log
~/biosoft/HISAT/current/hisat2 -p 5 -x $reference -U SRR3589961.fastq -S Akap951.sam 2>Akap951.log
~/biosoft/HISAT/current/hisat2 -p 5 -x $reference -U SRR3589962.fastq -S Akap952.sam 2>Akap952.log
ls sam |while read id;do (nohup samtools sort -n -@ 5 -o ${id%%.}.Nsort.bam $id &);done
但是让我意外的是比对率出奇的低！请看我结果。。。
0.48% overall alignment rate
0.62% overall alignment rate
0.48% overall alignment rate
0.49% overall alignment rate
起初我怀疑是参考基因组用错了，但是我查看了GEO里面的介绍，的确是mouse的ESC，所以我用grcm38没有问题！然后我怀疑是测序数据质量的问题，但是质量再差也不会导致如此低的比对率啊！所以我还是用fastqc检查了一下：
果然，质量值好到爆！
而且我抽取了几条序列去blat一下，发现也可以比对，而且明显是跨越intron的比对，超级经典的RNA-seq数据呀，这完全没问题啊。( 其实我这个blat结果也没有看仔细，正常的reads不应该被截成比对到基因组的正负链的，这其实预示着我把PE序列拼接了。)
那么就是我hisat2这个步骤的问题，我首先怀疑是不是我下载hisat的index搞错了，虽然看起来我命名是grcm38，但是有可能是我下载错误！我打开了sam文件看了看开头：
貌似的确是mouse基因组的染色体长度呀！很诡异，而且我清楚的记得，我下载的就是mouse的基因的索引。这里也没有问题。
https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml
难道grcm38与mm10有差别？ 我就先用bowtie2测试一下mm10吧，毕竟我还没有hisat2的mm10的index。
head -1000 SRR3589959.fastq >tmp.fq
~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 6 -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U tmp.fq -S tmp.sam
结果我挑出来的这1000条序列，全军覆没了，0.00% overall alignment rate，我傻眼了！ 没办法呀，逼着我换hg19参考基因组看看：
~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 6 -x ~/reference/index/bowtie/hg19 -U tmp.fq -S tmp.hg19.sam
仍然是全军覆没了，0.00% overall alignment rate，心好累，继续傻眼！
回过头看了看fastqc的报告，发现前面10个碱基的确有问题的！如果只是对RNA-seq进行定量，可能需要trim掉，但是我以前从来不trim，照样不影响比对。（如果你认真研究过测序流程，你应该知道前面这十个左右的碱基其实是bias）
不过，暂时看到这个问题，我就试着解决一下吧，先从这个思路来，而且比对工具里面本来就有这个选项，没必要自己来trim的！
具体参数网站：https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/manual.shtml
-5/--trim5 <int> trim <int> bases from 5'/left end of reads (0)
-3/--trim3 <int> trim <int> bases from 3'/right end of reads (0)
所以我加上了-p 6 -5 10 -3 10 --local 参数，比对人，可以拿到 35.60% overall alignment rate，比对mouse，可以拿到 98.80% overall alignment rate ，我勒个去，问题出来了，看起来好像是应该trim掉呀。以前的万能默认参数不行了？
但是有个问题，虽然我用local模式都比对上了，但是首先100bp的reads我切成了80，而且都是40M，40S，说明只有reads的一半成功比对到了参考基因组序列！
我然后用同样的参数，测试了hisat2工具，但是hisat2里面压根就没有local的选项，仅仅是trim一下，对比对的改善毫无意义，所以重点在于--local这个参数，但它只是表象，本质还是这个测序数据出问题了！
数据为什么会出问题呢?
终于，我想起了最开始的fastqc，决定再回过头看看测序数据的fastqc报告，请看下图，这么重要的图我居然忽略掉了，忽略掉了，略掉了，掉了，了。。。
再联想到前面的40M，40S我瞬间明白了，这肯定是一个双端测序被我搞成了单端测序数据！
而且我再去GEO介绍上面看，上面赫然写着PAIRED！ 我死也想不明白，我明明是加了--split-3 参数呀，为什么sra转换成fastq会出这么明显的错误呢？
然后我检查我的脚本，我自己从我的博客里面复制了我的代码。
唯一值得你看的就是上面这个图
是--不—是全角半角害死人，而且这个参数不识别它居然不停止，而是忽略我的参数！
是--不—是全角半角害死人，而且这个参数不识别它居然不停止，而是忽略我的参数！
是--不—是全角半角害死人，而且这个参数不识别它居然不停止，而是忽略我的参数！
更要命的是我把wget跟fastq-dump一起运行，而wget会给出一大堆的log日志把fastq-dump的报错日志给掩盖了。
此处请脑补我内心的呐喊！
因为前面一直处理的是单端的数据，所以这个错误没有被发现。
我痛恨我自己直接拷贝了博客的脚本！我痛恨 --这样的参数设置！
下面是我修改后的代码！
cut -f 3 config.txt |while read id ; do wget $id 2>/dev/null ;done
ls *sra |while read id; do ~/biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64/bin/fastq-dump --gzip --split-3 $id;done
这就是老司机翻车以及我debug的心路历程，希望你们引以为戒！
因为太熟练了，所以我已经很久没有关心过完整的fastqc报告。
因为太熟练了，所以我把wget跟fastq-dump一起运行，很久没关心过log文件。
因为太熟练了，所以我对用了一千遍fastq-dump的命令产生了一万个放心。
因为太熟练了，所以我先想了各种复杂的情况而没有一开始就从最简单的问题入手。
所以，一切看起来都是因为我是一个老司机！
对了，顺便说一句，我已经把下好的sra数据删除了!（你想笑就笑吧）
如果你认为自己还是一个菜鸟就请记住老司机的这句话：
行走江湖，靠的是一个稳字
文：Jimmy
编辑校对：一只思考问题的熊