今天继续给大家分享一篇单细胞测序在癌症研究中的应用的文章，看完这篇文章大家会不会跟小编一样感慨：“ 哇，这个结果一看就懂，我怎么就没想到这个研究思路呢！”这应该就是好的课题设计会给大家带来的思考。话不多说，赶紧一起感受一下这看似简单的研究内容吧。文章题目：Dissecting tranional heterogeneity in primary gastric adenocarcinoma by single cell RNA sequencing。

研究背景

胃腺癌(GA)是一种典型的异质性恶性肿瘤，具有不同的亚型和临床表现。根据细胞形态与组织化学,将胃癌分为肠型、弥漫型和混合型三类。近年来TCGA基因分型提出了一种新的分子分类方法，将GA分为四种亚型：EBV阳性肿瘤、微卫星不稳定肿瘤、基因组稳定肿瘤和染色体不稳定肿瘤。然而，这些研究结果来自大块组织的数据，模糊了不同细胞亚群的分子特征，限制了捕捉肿瘤异质性的能力。在这项研究中，作者利用scRNA-seq构建了系统的GA转录图谱，通过将Lauren病理类型与肿瘤分子特征相结合，更有力地揭示了GA的异质性，并为GA的临床诊断和预后提供理论基础。

数据来源

（1）scRNA-seq数据：对来自9个肿瘤和3个非肿瘤样本的27677个细胞进行了单细胞转录组测序（5个肠型GA样本，其中1个EBV感染；3个混合型GA样本；1个弥漫型GA样本和3个作为对照的非恶性组织样本）。

（2）bulk RNA-seq数据：TCGA胃腺癌(STAD)数据集中成对的肿瘤和正常组织样本。

研究思路

结果展示

1.细胞聚类分析

作者首先通过聚类分析将细胞划分为14个簇，再通过标记基因，将这些簇划分为9个已知的细胞谱系：上皮细胞，壁细胞，内分泌细胞；B细胞；T细胞；肥大细胞，成纤维细胞，内皮细胞，每个细胞谱系的比例在不同样本之间差别很大。

2.TCGA bulk RNA-seq数据揭示恶性上皮和非恶性上皮细胞的分子特征差异

作者根据TCGA胃腺癌(STAD)数据集中成对的肿瘤和正常组织样本之间的差异表达基因，定义了每个上皮细胞的恶性和非恶性评分，进而区分恶性上皮和非恶性上皮细胞。一组肿瘤特异性基因，包括CLDN4、CLDN7、TFF3和REG4，在恶性上皮中较非恶性上皮上调，非恶性上皮中与胃粘液和消化酶分泌相关的标志物基因如MUC5AC、GKN1、PGC和LIPF均高表达。GSEA富集分析结果显示与非恶性上皮相比，恶性上皮富含肿瘤坏死因子-α/核因子-kappaB、KRAS和白细胞介素6/Janus激酶/信号转导和转录激活因子等信号通路。该结果证明了用于恶性细胞鉴定方法的可靠性。拷贝数变异(CNV)推断分析已被应用于单细胞分析中的恶性细胞识别，在该研究中只有25.0%的疑似恶性细胞表现出高水平的CNV。同时TCGA分析结果发现大多数GA样品经全外显子测序检测到CNV信号较低，综上表明基于CNV信号的恶性细胞鉴定不适合于胃腺癌研究。

3.GA非恶性上皮细胞的亚型分类及轨迹分析

作者对非恶性细胞进行了亚聚类，鉴定识别出四个不同的细胞亚群：G1组表达TFF2、GKN1和MUC5AC基因，为表面细胞；G2组细胞高表达PGA3、PGA4、LIPF等标记基因，为主细胞；G3的细胞表达标记PGA3和MUC6，被定义为增生/肥大的粘液颈部细胞；G4组主要由来自癌变粘膜的细胞组成，将其定性为胃化生细胞（SPEM）。之后通过免疫组织化学染色实验证实了四种不同亚型细胞的存。接下来，作者通过细胞轨迹分析研究细胞类型之间的潜在转变，分析结果表明，主细胞可以转分化为黏膜颈部细胞，然后再分化为SPEM，说明主细胞可能是化生细胞系的起源，也可能是胃肿瘤细胞的起源。

4.GA恶性上皮细胞转录图谱的异质性

对恶性细胞进行了聚类分析，发现了5个显著的细胞亚群(C1-C5)。在9名患者样本中，C1-C5的比例各不相同，C1几乎全部来自弥漫型样本(DGC)，而C2主要来自肠型样本(IGC)，C3含有混合型(MGC)和肠型样本的细胞，C4主要来源于一个肠型GC样本(IGC3)，C5由EBV阳性患者的细胞组成(IGC5)。通过比较基因表达谱发现C1、C2、C3符合Lauren分类的三个典型亚型，C4和C5是两个新的细胞亚群，与C1/C2/C3相比具有不同的分子特征。

为了定量探讨肿瘤内和肿瘤间恶性细胞分化的异质性，作者基于KRT20(一种上皮分化相关基因)及其正相关的细胞分化标记基因定义了一个分化评分。结果显示不同亚组和不同患者的分化分数不同，显示出高度的肿瘤间异质性，还发现IGC1和IGC4患者的肿瘤内分化异质性很高，其中包含两个不同分化评分的细胞群，这也得到了KRT20免疫染色的验证。此外，IGC1和IGC4的恶性细胞从低度分化到高度分化显示出相似的伪时间轨迹。这些结果表明，IGC1和IGC4中不同的细胞群可能代表了两个不同的分化阶段。接下来，作者通过生存分析评估了bulk RNA-seq TCGA STAD数据集中肿瘤分化程度与患者预后的关系，结果显示，低分化分数显著预测的总体生存较差，这表明分化程度低的胃癌可能更具侵袭性。

5.具有Lauren分类的恶性细胞亚型分子特征

前面说到C1、C2和C3是符合Lauren分类的三个典型细胞亚型，那这三类细胞亚型有什么样的分子特征呢？作者根据scRNA-seq基因表达谱进行了深入的挖掘。C1高表达一些在胃上皮细胞中广泛表达的基因，C2表现出与小肠相似的显著分子特征，C3没有明显的分子特征，但部分表达了C1和C2的标记，表明它是C1和C2的中间亚群。三个亚组之间的分化分数表明，C1代表未分化状态的亚群，C2代表具有成熟肠细胞特征的高分化恶性细胞的不同亚群，而C3代表介于C1和C2之间的中间状态。

6.GA-FG-CCP转录组图谱分析

C4恶性细胞主要来源于肠型GA样本IGC3，GO富集分析发现在C4中特异表达的基因在生长调控和Wnt/β-catenin信号通路中显著富集。C4亚组的组织病理学结果和细胞表型表达模式与主细胞主导型胃底腺癌（GA-FG-CCP）的细胞特征高度一致。之后作者发现在两个公共bulk RNA-seq数据集(TCGA和新加坡数据集)中都有GA-FG-CCP细胞类型的存在。而且发现GA-FG-CCP病例的组织病理学图像与IGC3的组织病理学结果高度一致。总之，GA-FG-CCP病例可能是一种罕见的GA类型，这是第一次在单细胞分辨率下显示GA-FG-CCP的组织病理学和表型特征的研究，该研究结果能够加深我们对胃肿瘤细胞和分子多样性的理解。

7.EBV+恶性细胞高表达免疫标志基因

C5亚群几乎全部由EBV感染的肠型患者(IGC5)的细胞组成。绝大多数C5细胞表现出独特的分子特征：高水平的淋巴细胞抗原-6(Ly6)家族成员和MHC-II基因，它们与免疫反应密切相关。GO富集分析表明，这一亚群显示出高水平的免疫相关信号通路，如干扰素-α(干扰素-α)反应、抗原处理和呈递，这表明免疫细胞和肿瘤细胞之间可能存在细胞间的通讯。总之，研究结果说明EBV感染是GA的致病因素，可能在免疫系统激活和肿瘤细胞表型改变中发挥重要作用，而且EBV阳性的GA具有免疫活性。因此，EBV感染检测应成为GA临床治疗的必要组成部分。

研究总结

文章亮点：

同样是肿瘤细胞亚型分类，该文章并不是像其它大多数文章将肿瘤细胞分为免疫细胞和非免疫细胞，而是分类为恶性/非恶性细胞，再将Lauren病理类型与肿瘤分子特征相结合，更有力地揭示了GA的异质性，并为GA的临床诊断和预后提供理论基础。细胞分类的逻辑与角度不同，挖掘出不一样的临床意义！

该研究的新发现：

（1）在单细胞分辨率下构建不同胃腺癌亚型的转录组图谱；

（2）揭示了肿瘤细胞分化程度与预后的关系；

（3）发现了非恶性上皮细胞的细胞谱系演进关系，即胃化生细胞（SPEM）来源于主细胞的去分化；

（4）发现了一种罕见的胃癌变异型GA-FG-CCP，并在两个公开的批量转录数据集中验证了它的存在。

（5）揭示了EBV感染是GA的致病因素，可能在免疫系统激活和肿瘤细胞表型改变中发挥重要作用。

该研究的临床意义：

（1）综合系统的转录组图谱，为破解胃肿瘤异质性提供了宝贵资源；

（2）肿瘤分化程度是预测GA预后的良好指标；

（3）对潜在主细胞转化的轨迹分析有助于阐明胃癌的发生机制；

（4）发现了一种罕见的GA类型（GA-FG-CCP），为胃肿瘤异质性的研究提供了有价值的资源。

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