如何用FAPROTAX预测微生物群落功能
本文转载自微生物生态公众号，己获授权。主编刘永鑫对本文进行了测试、版本更新、添加部分操作代码。
前段时间卢瑟菌已经给大家普及了基于原核16S rDNA高通量测序结果对微生物群落功能或表型进行预测的四种方法——PICRUSt、Tax4Fun、FAPROTAX及BugBase（详细戳这里）。本篇软文针对功能预测的一支新秀——FAPROTAX，详细介绍其使用方法。
关于FAPROTAX的介绍可参阅官网说明或卢瑟菌的软文。
FAPROTAX官网链接：
http://www.zoology.ubc.ca/louca/FAPROTAX/lib/php/index.php?section=Instructions
这里简单一提
FAPROTAX原理：
作者先根据文献资料手动构建了联系物种分类与功能注释的FAPROTAX数据库；后又编写了联系OTU分类表与FAPROTAX数据库的python脚本；最后，只要将基于16S的OTU分类表通过python脚本就可以输出微生物群落功能注释预测结果（如下图）。
FAPROTAX特点：
FAPROTAX较适用于对环境样本（如海洋、湖泊等）的生物地球化学循环过程（特别是碳、氢、氮、磷、硫等元素循环）进行功能注释预测。因其基于已发表验证的可培养菌文献，其预测准确度较好，但相比于上述PICRUSt和Tax4Fun来说预测的覆盖度可能会降低。
PICRUSt输入的物种丰度表目前只能用Greengene数据库进行物种注释，在这一点上FAPROTAX更灵活，因为它识别的是菌的属、种的名称，只要你注释到的菌己被报导有这方面的功能，无论注释数据库是Greengene、Silva和RDP，OTU是有参考还是de novo的结果都可以识别。！
在使用FAPROTAX做功能预测前，有一些准备工作：
a、FAPROTAX脚本collapse_table.py下载（请使用python 2.7）；
b、FAPROTAX功能注释数据库下载；
c、物种丰度表已生成（文本格式、Biom格式）。
FAPROTAX脚本及数据库下载：
FAPROTAX是由python语言编写的脚本collapse_table.py
当前最新版本依然是FAPROTAX 1.1，2017年6月10日更新，安装方法如下：
wget http://www.zoology.ubc.ca/louca/FAPROTAX/SECTION_Download/MODULE_Downloads/CLASS_Latest%20release/UNIT_FAPROTAX_1.1/FAPROTAX_1.1.tar.gz # 下载
tar -xvzf FAPROTAX_1.1.tar.gz # 解压
python FAPROTAX_1.1/collapse_table.py # 测试是否可运行，弹出帮助即正常工作 June 10, 2017更新数据库假设说我们通过OTU聚类、物种分类注释，已经得到了物种丰度表，接下来我们就可以使用FAPROTAX进行功能预测了！
FAPROTAX可识别的物种丰度表有两种，一种是文本格式（classical (tabular) taxon tables），一种是Biom格式。
1）文本格式命令行：
# 文本OTU表中存在名为taxonomy的列，包括物种分类学信息
biom convert -i result/otu_table_tax.biom -o result/otu_table_tax.txt --table-type="OTU table" --to-tsv --header-key taxonomy
# 将包括物种信息的OTU表转换为功能注释分类表
python FAPROTAX_1.1/collapse_table.py -i result/otu_table_tax.txt -o result/otu_table_tax.faprotax -g FAPROTAX_1.1/FAPROTAX.txt --column_names_are_in last_comment_line -d 'taxonomy' -c '#' -v --force
# --column_names_are_in last_comment_line 指定注释为最后一行
# -d 批定物种信息的列名
2）Biom格式命令行：
# 注释在OTU表最后一列类型，常用
python FAPROTAX_1.1/collapse_table.py -i result/otu_table_tax.biom -o result/otu_table_tax.faprotax -g FAPROTAX_1.1/FAPROTAX.txt --collapse_by_metadata 'taxonomy' -v --force
# 另一种为OTU表行名即为物种信息，通常为summarize_taxa.py生成属水平biom格式
python FAPROTAX_1.1/collapse_table.py -i result/sum_taxa/otu_table4_L6.txt -o result/otu_table_tax.faprotax -g FAPROTAX_1.1/FAPROTAX.txt --force -v
上述，
-i输入文件，物种丰度表；
-g输入文件，FAPROTAX数据库；
-o输出文件，功能丰度表；
--collapse_by_metadata指定biom中的物种信息列
这三个是所有选项中最基本的选项！在其他选项均为默认的情况下，是最简短的命令行。
如果你觉得这三个选项满足不了你的需要，可详细了解更多选项：
http://www.zoology.ubc.ca/louca/FAPROTAX/lib/php/index.php?section=Instructions
以上不同格式得到一个相同的功能表。
-i, --input_table（必选）
输入，OTU表，tabular或BIOM格式。
-g, --input_groups_file（必选）
输入，FAPROTAX数据库。
-o, --out_collapsed（可选）
输出，功能表，总表。
-s, --out_sub_tables_dir（可选）
输出，功能表，分表，每类功能单独生成一个表(one per functional group)，表内仅包含功能相关的OTU。
-r, --out_report（可选）
输出，报告文件，记录每个OTU相关的功能group。
--out_groups2records_table（可选）
输出，列出哪些OTUs与哪组功能相关。1 (association)，0 (no association)。
--out_group_overlaps（可选）
输出，列出两组功能共有的OTUs。
--out_group_definitions_used（可选）
输出，输出指定功能group。
-d, --row_names_are_in_column（可选）
指定行名（物种分类）所在列，仅限文本输入文件，首列列号为0，以此类推。
--collapse_by_metadata（可选）
指定行名（物种分类）所在列，仅限Biom输入文件，首列列号为0，以此类推。
--dont_parse_group_metadata（可选）
输出文件不包含任何功能信息。
--column_names_are_in（可选）
指定输入文本文件列名（e.g. sample names）所在位置：'none' (无列名), 'last_comment_line' 和 'first_data_line' (default).
--table_delimiter（可选）
指定输入文本文件分隔方式，默认为'tab'。
--omit_columns（可选）
忽略某列，首列列号为0，以此类推。如要去掉第1,102-104列：--omit_columns '0,101,102,103'。
--group_leftovers_as（可选）
命名未注释到功能的分类，如标记为 'other'：--group_leftovers_as 'other'。
-n, --normalize_collapsed（可选）
标准化输出：'none'(不进行标准化, default), 'columns_before_collapsing' (TSS of the OTU table), 'columns_after_collapsing' (TSS of the function table), 'columns_before_collapsing_excluding_unassigned' (TSS of the OTU table restricted to functionally assigned OTUs)。
-v, --verbose（可选）
展示命令执行过程细节
-f, --force（可选）
强制覆盖已存在文件
-h, --help（可选）
帮助文件
如果你觉得看选项的解释不够形象，那么下面有一些选项运用实例。
1）帮助选项
collapse_table.py -h
2）Biom格式输入、输出，-v 展示命令执行过程细节
collapse_table.py -i tax_table.biom -o func_table.biom -g FAPROTAX.txt -v
注：此处biom表内的IDs对应的是分类信息而不是OTU编号，可由Qiime脚本summarize_taxa.py或summarize_taxa_through_plots.py产生。
3）如果biom表内IDs对应的不是分类信息，则需要指定分类信息所在表内的位置（列），如“taxonomy”。
collapse_table.py -i tax_table.biom -o func_table.biom -g FAPROTAX.txt -v --collapse_by_metadata 'taxonomy'
注：make_otu_table.py或pick_open_reference_otus.py等Qiime脚本产生的biom表属于这种类型。--collapse_by_metadata仅限使用在Biom格式输入时。
4)文本格式（classical (tabular) taxon tables）输入、输出，-d指定分类信息所在表内的位置（列）。
制表符分隔的文本文件
collapse_table.py -i tax_table.tsv -o func_table.tsv -g FAPROTAX.txt -v -d 'taxonomy' -c '#'
注：-d仅限使用在文本格式输入时。输入文件格式，每一行表示一个分类taxa，每一列表示一个物种，物种分类信息存储在名为“taxonomy”的列内。-c # 是说，当文件内出现“#”时，忽略此行（即与“#”的通常用法一致），这就保证，文件的第一个非注释（无“#”）行是列名header line。
5）如果列名也含有“#”，可以使用"--column_names_are_in last_comment_line"告诉电脑，最后一个注释行是列名
collapse_table.py -i tax_table.tsv -o func_table.tsv -g FAPROTAX.txt --column_names_are_in last_comment_line -d 'taxonomy' -c '#' -v
6）如果文件内没有列名，可使用"--column_names_are_in none"告诉电脑列名为空，这样就需要指出物种分类存在于哪一列，如下0表示第一列，以此类推。
collapse_table.py -i tax_table.tsv -o func_table.tsv -g FAPROTAX.txt --column_names_are_in none -c '#' -v -d 0
7）如果表格有多余的列，如第一列为OTU编号时，或是有样品列不想保存到输出文件，可运行如下指令（例，去掉第1,102-104列）
collapse_table.py -i tax_table.tsv -o func_table.tsv -g FAPROTAX.txt -d 'taxonomy' -c '#' --omit_columns '0,101,102,103' -v
8）未注释到功能的物种分类，标记上other
collapse_table.py -i tax_table.biom -o func_table.biom -g FAPROTAX.txt --group_leftovers_as 'other' -v
9）输出报告文件
collapse_table.py -i tax_table.biom -o func_table.biom -g FAPROTAX.txt -r report.txt -v
10）标准化输出
collapse_table.py -i tax_table.biom -o func_table.biom -g FAPROTAX.txt -n columns_after_collapsing -v
11）指定输出格式。默认情况下，输入和输出格式相同（同为biom或文本格式）。使用"--output_format_collapsed"可指定输出格式
collapse_table.py -i tax_table.biom -o func_table.tsv -g FAPROTAX.txt --output_format_collapsed classical -v
1）物种分类格式
以下是三种可用的物种分类的格式，不同层次分类用分号隔开，分别表示界、门、纲、目、科、属、种…
k__Bacteria;p__Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Xanthomonadales;f__Xanthomonadaceae;g__Thermomonas;s__fusca
D_0__Bacteria;D_1__Firmicutes;D_2__Bacilli;D_3__Bacillales;D_4__Bacillaceae;D_5__Bacillus;D_6__Bacillus sp. YZ5
Bacteria; Chlorobi; Chlorobia; Chlorobiales; Chlorobiaceae; Chlorobaculum; Chlorobaculum thiosulfatiphilum DSM249T
2）序列注释后，经常会产生一些不够详细的物种分类信息，如注释不到科、属水平。FAPROTAX也允许这种输入，但是这种情况下由于分类不够详细，相应的，能够预测出的功能也更少。
FAPROTAX的输出结果格式如下：
1）report文件：详细记录了每个功能包含多少个OTU（物种分类），以及包含哪些OTU。基于此，我们可以根据关注的功能找到对应的OTU。
2）功能丰度表：第一列为预测的功能列表，其余为样品列，数值表示相对丰度。基于功能丰度表，我们就可以做出各种样式美美的图。
参考文献：
Louca S, Parfrey L W, Doebeli M. Decoupling function and taxonomy in the global ocean microbiome[J]. Science, 2016, 353(6305): 1272-1277.
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学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”