10X单细胞3'转录组建库原理

10X Genomics公司的单细胞3'转录组解决方案主要有V2、V3两个试剂版本，V3版本是相对于V2版本的升级，实验过程和基本原理相同，以下我们将回顾10X单细胞3‘转录组的建库原理，其中会涉及V2、V3两个试剂版本在文库结构上的异同。

Schematic of a SC3’ v2 Gel Bead oligo primer

Chromium Single Cell 3’ v3 Gel Bead schematic

V2和V3版本的实验过程和基本原理相同，用于生成3'基因表达文库的Gel Bead poly(dT) Primers差异主要是UMI随机序列长度从10bp增加到了12bp，UMI多样性增加，相应的Gel Beads上Primers的数量也从73多万种增加到350多万种，在相同测序深度下V3能发现更多的基因；GEMs（油包水）数量未有改变，还是能鉴定500-10,000个细胞。

除以上之外，Single Cell 3ʹ v3 Gel Beads还提供另外两种primer（Capture Sequence 1 and Capture Sequence 2），这两种primer能够分别用于Feature Barcoding技术的细胞表面蛋白表达鉴定以及单细胞CRISPR筛选，这两种后续文章会专门讲。

主要实验过程如下图

含有细胞的油滴占所有油滴比例大约5%，更好的保证了含有细胞的油滴里面只有1个细胞，一个包含细胞的油滴内就是一个单细胞scRNA-Seq。

每个GEMs内包含独特的10X barcode用于区分不同的单细胞；

每个GEMs内相同的10X barcode与不同的UMI组成用于区分不同转录本的Gel Bead poly(dT) Primers。

V2版本试剂产生的文库结构：

V3版本试剂产生的文库结构：

各引物序列总结如下：

Beads-oligo-dT

Template Switching Oligo (TSO)

5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG -3'

cDNA Forward primer

5'- CTACACGACGCTCTTCCGATCT -3'

cDNA Reverse primer

V2: 5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT -3'

V3: 5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG -3'

Illumina Truseq Read 1 primer

5'- TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT -3'

Illumina Truseq Read 2 primer

5'- GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3'

Truseq adapter (double stranded DNA with a T overhang)

Library PCR primer 1

5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC -3'

Library PCR primer 2

5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[8-bp sample index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT -3'

Sample index sequencing primer

5'- AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC -3'

Illumina P5 adapter

5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3'

Illumina P7 adapter

5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3'

rGrGrG的作用是：提高结构稳定性，利于TSO引物跟多出来的C结合，文献里也是试了很多种不同的TSO3’端结构和修饰，这个rGrGrG在测试结果表现优良

V3版本试剂产生的文库结构：

到底是怎样的实验过程使Gel Bead poly(dT) Primers与成熟的mRNA组合形成了这样的文库结构呢？

这一章节我们将Step-by-step 解读文库的产生。

每一个GEMs均是Gel Bead + Master Mix + Cell Lysate的混合

在GEM中Beads-oligo-dT引物参与mRNA的捕获，反转录酶采用MMLV，MMLV的末端转移酶活性在末端加Cs。

加入TSO引物，TSO的rGrGrG结合第一链的Cs，以第一链cDNA为模版进行延伸。

扩增后的cDNA大约几百ng，文库片段大小集中在1-2kb：

PS：这里的cDNA是全长的转录本，所以从这一步骤之后，如果能够通过片段筛选+PCR循环数及加入接头的选择控制，可以探讨结合三代测序仪实现单细胞ISO-seq的可能

在GEMs中的过程到这结束了，后续的过程是所有细胞的cDNA混合在一起进行处理。

加入cDNA Forward 和 Reverse primers扩增全长cDNA

不同的细胞数量扩增的循环数不同，对应列表如下：

一般样品的细胞数量为5000,8000，和10000的居多，所以循环数基本是11或12个

使用Fragmentase实现扩增后cDNA的片段化及末端加A修饰，为后续Illumina Truseq adapter的添加做准备

cDNA文库加入Fragmentase后，有3种产物

Product 1 (TSO plus 5'-end of cDNA)

Product 2 (middle of cDNA)

Product 3 (Illumina Read 1 sequence, cell barcode, UMI plus 3' of cDNA)

这个Product3才是我们后续文库构建需要的产物

打断后的cDNA中加入Illumina Trueseq adapter Read2（with a T overhang）进行连接，对应上一步会形成3中产物

Product 1

因为TSO的5' end 是被阻断的，所以adapter 只会和cDNA end相连

Product 2

这一部分产物会因为semi suppressive PCR而不能被有效的扩增？？，待确定

这部分Product2是不能长在Illumina的FlowCell上被测到的

Product 3

上一步连接Read2之后加入P5和P7，加入P5和P7，结合Read1 Read2进行指数扩增放大文库