使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality

基本分析

在本节中，我们将使用immunarch包中的基本函数对免疫组库数据进行常规分析。

常用函数如下：

• repExplore- 计算基本统计数据，例如克隆数或长度和计数的分布。要探索它们，您需要将统计信息如“count”传递给.method参数.
• repClonality - 计算TCR/BCR库的克隆性。
• repOverlap - 计算不同TCR/BCR库的重叠性。
• repOverlapAnalysis - 分析TCR/BCR库的重叠，包括不同的聚类程序和 PCA。
• geneUsage - 计算V或J基因的分布。
• geneUsageAnalysis - 分析V或J基因的分布，包括聚类和PCA。
• repDiversity - 估计TCR/BCR库的多样性。
• trackClonotypes - 分析跨时间点的TCR/BCR库动态。
• spectratype - 计算克隆型的谱型。
• getKmers和kmer_profile- 计算 kmers 和序列配置文件的分布。

可视化分析结果

在immunarch中，每个函数的分析结果都可以直接传递给vis函数进行可视化，它是一个通用的可视化函数。同时，我们还可以通过.by参数传递任一分组变量，或同时将.by和.meta参数传递给 vis函数来进行分组展示。

• 
  
1. 我们可以通过.by参数将元数据表中的一个或多个列名称作为字符向量传递，以便在绘图之前对数据进行分组。在这种情况下，您还应该提供.meta元数据表的参数。

exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
#         Sample Volume
# A2-i129 A2-i129   6443
# A2-i131 A2-i131   6375
# A2-i133 A2-i133   6300
# A2-i132 A2-i132   6721
# A4-i191 A4-i191   5058
# A4-i192 A4-i192   5763

p1 <- vis(exp_vol, .by = c("Status"), .meta = immdata$meta)
p2 <- vis(exp_vol, .by = c("Status", "Sex"), .meta = immdata$meta)
# p1 + p2

• 
  
2. 我们还可以将.by字符向量作为与数据中样本数量完全匹配的字符向量传递，每个值应对应于一个样本的属性。它将用于根据提供的值对数据进行分组。请注意，在这种情况下，您应该将 NA 传递给.meta.

exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
by_vec <- c("C", "C", "C", "C", "C", "C", "MS", "MS", "MS", "MS", "MS", "MS")
p <- vis(exp_vol, .by = by_vec)
p

当数据被分组后，immunarch包会默认执行组间均值比较的统计检验，除非设置参数.test = F。如果只有两个组，则执行Wilcoxon 秩和检验（wilcox.test带有参数的R 函数exact = F）以测试两组之间的平均秩值是否存在差异。如果有两个以上的组，则执行Kruskal-Wallis 检验（R 函数kruskal.test），这相当于秩合方差分析，它测试来自不同组的样本是否来自同一分布。一个显著的 Kruskal-Wallis 检验结果表明至少一个样本随机地支配另一个样本。多重比较调整后的 P 值绘制在组的顶部。P 值调整是使用Holm 方法（也称为 Holm-Bonferroni 校正）。您可以[?p.adjust](https://rdrr.io/r/stats/p.adjust.html)在 R 控制台中执行该命令以查看更多信息。

该vis函数生成的图以及任何基于 ggplot2 的图都可以传递给 —fixVis内置交互式可视化工具，用于制作可发表的图：

# 1. Analyse
exp_len <- repExplore(immdata$data, .method = "len", .col = "aa")
#  Sample Length Count
# 1 A2-i129      6     1
# 2 A2-i129      9     6
# 3 A2-i129     10    36
# 4 A2-i129     11   243
# 5 A2-i129     12   517
# 6 A2-i129     13  1081

# 2. Visualise
p1 <- vis(exp_len)

# 3. Fix and make publication-ready results
fixVis(p1)

探索性可视化分析

对于基本的探索性分析，例如比较每个曲目的读取数/UMI 或分布，请使用该函数repExplore。

exp_len <- repExplore(immdata$data, .method = "len", .col = "aa")
head(exp_len)
#   Sample Length Count
# 1 A2-i129      6     1
# 2 A2-i129      9     6
# 3 A2-i129     10    36
# 4 A2-i129     11   243
# 5 A2-i129     12   517
# 6 A2-i129     13  1081

exp_cnt <- repExplore(immdata$data, .method = "count")
head(exp_cnt)
#   Sample Clone.num Clonotypes
# 1 A2-i129         1       5858
# 2 A2-i129         2        388
# 3 A2-i129         3         86
# 4 A2-i129         4         26
# 5 A2-i129         5         25
# 6 A2-i129         6          6

exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
head(exp_vol)
 #        Sample Volume
# A2-i129 A2-i129   6443
# A2-i131 A2-i131   6375
# A2-i133 A2-i133   6300
# A2-i132 A2-i132   6721
# A4-i191 A4-i191   5058
# A4-i192 A4-i192   5763

p1 <- vis(exp_len)
p2 <- vis(exp_cnt)
p3 <- vis(exp_vol)

p1

p2 + p3

# You can group samples by their metainformation
p4 <- vis(exp_len, .by = "Status", .meta = immdata$meta)
p5 <- vis(exp_cnt, .by = "Sex", .meta = immdata$meta)
p6 <- vis(exp_vol, .by = c("Status", "Sex"), .meta = immdata$meta)

p4

p5 + p6

克隆性分析

估计样本多样性的方法之一是评估克隆性。repClonality函数可以计算最频繁或最不常见的克隆型的数量。有几种方法可以评估克隆性，让我们来看看它们。该clonal.prop方法计算细胞克隆池占据的所有库的比例：

imm_pr  <-  repClonality ( immdata$data , .method  =  "clonal.prop" )
imm_pr
##         Clones Percentage Clonal.count.prop
## A2-i129     18       10.0      0.0027556644
## A2-i131     28       10.0      0.0042728521
## A2-i133      9       10.3      0.0014077898
## A2-i132    113       10.0      0.0164987589
## A4-i191      4       11.5      0.0007773028
## A4-i192      8       10.4      0.0013738623
## MS1          2       10.1      0.0003700278
## MS2         66       10.0      0.0092372288
## MS3          2       10.6      0.0003095496
## MS4        176       10.0      0.0236336780
## MS5          3       13.2      0.0005303164
## MS6        150       10.0      0.0202456472
## attr(,"class")
## [1] "immunr_clonal_prop" "matrix"

该top方法考虑了最丰富的细胞克隆型：

imm_top <- repClonality(immdata$data, .method = "top", .head = c(10, 100, 1000, 3000, 10000))
imm_top
##                 10        100      1000      3000 10000
## A2-i129 0.08011765 0.17282353 0.3491765 0.5844706     1
## A2-i131 0.06670588 0.15647059 0.3467059 0.5820000     1
## A2-i133 0.10505882 0.18294118 0.3655294 0.6008235     1
## A2-i132 0.02388235 0.09423529 0.3118824 0.5471765     1
## A4-i191 0.17176471 0.32047059 0.5122353 0.7475294     1
## A4-i192 0.11541176 0.22141176 0.4325882 0.6678824     1
## MS1     0.19164706 0.30894118 0.4817647 0.7170588     1
## MS2     0.04458824 0.11470588 0.2770588 0.5123529     1
## MS3     0.16482353 0.23011765 0.3575294 0.5928235     1
## MS4     0.02329412 0.07517647 0.2415294 0.4768235     1
## MS5     0.20611765 0.29188235 0.4521176 0.6874118     1
## MS6     0.02835294 0.08235294 0.2460000 0.4812941     1
## attr(,"class")
## [1] "immunr_top_prop" "matrix"

该rare方法处理丰度最低的克隆型：