Monocle2包学习笔记（四）：Differential Expression Analysis

差异基因表达分析是RNA-Seq实验中的常见任务，Monocle2可以帮助我们找到在不同组细胞之间差异表达的基因，并评估这些基因差异表达变化的统计学意义。

Basic Differential Analysis

这里，我们查看成肌细胞（myogenesis）数据在不同培养条件下的差异表达基因。

# 选择myogenesis相关的基因集
marker_genes <- row.names(subset(fData(HSMM_myo),
                   gene_short_name %in% c("MEF2C", "MEF2D", "MYF5",
                                          "ANPEP", "PDGFRA","MYOG",
                                          "TPM1",  "TPM2",  "MYH2",
                                          "MYH3",  "NCAM1", "TNNT1",
                                          "TNNT2", "TNNC1", "CDK1",
                                          "CDK2",  "CCNB1", "CCNB2",
                                          "CCND1", "CCNA1", "ID1")))

# 使用differentialGeneTest函数对myogenesis基因集中的基因进行差异表达分析
diff_test_res <- differentialGeneTest(HSMM_myo[marker_genes,],
                                      fullModelFormulaStr = "~Media")

# Select genes that are significant at an FDR < 10%
# 筛选显著的差异表达基因
sig_genes <- subset(diff_test_res, qval < 0.1)

# 对marker基因的表达进行可视化
MYOG_ID1 <- HSMM_myo[row.names(subset(fData(HSMM_myo),
              gene_short_name %in% c("MYOG", "CCNB2"))),]
plot_genes_jitter(MYOG_ID1, 
                  grouping = "Media", 
                  ncol= 2)

Finding Genes that Distinguish Cell Type or State

接下来，我们根据几个关键的marker基因将成肌细胞(myoblasts)与成纤维细胞(fibroblasts)区分开来，使用Monocle2查看成纤维细胞和成肌细胞之间差异表达的基因。

# 选择marker基因
to_be_tested <- row.names(subset(fData(HSMM),
                          gene_short_name %in% c("UBC", "NCAM1", "ANPEP")))
cds_subset <- HSMM[to_be_tested,]

# 使用differentialGeneTest函数对不同细胞类型进行差异表达分析
diff_test_res <- differentialGeneTest(cds_subset,
                                      fullModelFormulaStr = "~CellType")
diff_test_res[,c("gene_short_name", "pval", "qval")]

# 基因表达可视化
plot_genes_jitter(cds_subset,
                  grouping = "CellType",
                  color_by = "CellType",
                  nrow= 1,
                  ncol = NULL,
                  plot_trend = TRUE)

Finding Genes that Change as a Function of Pseudotime

Monocle2还可以基于拟时序分析的结果查看随着细胞进展而变化的基因。同样，我们需要指定用于差异分析的模型。这个模型比我们之前用来查看CellType之间差异的模型要复杂一些。Monocle2为每个细胞分配一个“伪时间”值，该值记录了其在实验过程中的进度。Monocle2使用VGAM软件包将基因的表达水平建模为伪时间的平滑非线性函数。

to_be_tested <- row.names(subset(fData(HSMM),
                          gene_short_name %in% c("MYH3", "MEF2C", "CCNB2", "TNNT1")))
cds_subset <- HSMM_myo[to_be_tested,]

# 使用differentialGeneTest函数进行差异表达分析
diff_test_res <- differentialGeneTest(cds_subset,
                                      fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")

# 使用plot_genes_in_pseudotime函数对基因的表达水平进行可视化
plot_genes_in_pseudotime(cds_subset, 
                         color_by = "Hours")

Clustering Genes by Pseudotemporal Expression Pattern

Monocle2可以对具有相似表达趋势的基因进行分组，并对其进行可视化展示。Monocle2使用plot_pseudotime_heatmap函数基于CellDataSet对象（通常仅包含重要基因的子集）生成平滑的表达曲线，类似于plot_genes_in_pseudotime函数。然后，将这些基因进行聚类，并使用pheatmap包对其进行热图绘制。

# 差异表达分析
diff_test_res <- differentialGeneTest(HSMM_myo[marker_genes,],
                                      fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")
# 选择显著的差异基因
sig_gene_names <- row.names(subset(diff_test_res, qval < 0.1))

# 使用plot_pseudotime_heatmap函数进行聚类分组可视化
plot_pseudotime_heatmap(HSMM_myo[sig_gene_names,],
                        num_clusters = 3,
                        cores = 1,
                        show_rownames = T)

Multi-Factorial Differential Expression Analysis

Monocle2还可以在存在多种因素的情况下执行差异表达分析，这可以帮助我们减去某些因素以查看其他因素的影响。为此，我们必须同时指定完整模型和简化模型。这里，我们指定完整模型捕获CellType和Hours的效果，而简化模型仅捕获Hours的影响。

to_be_tested <- row.names(subset(fData(HSMM),
                          gene_short_name %in% c("TPM1", "MYH3", "CCNB2", "GAPDH")))

cds_subset <- HSMM[to_be_tested,]

diff_test_res <- differentialGeneTest(cds_subset,
                                      fullModelFormulaStr = "~CellType + Hours",
                                      reducedModelFormulaStr = "~Hours")

plot_genes_jitter(cds_subset, 
                  grouping = "Hours", 
                  color_by = "CellType", 
                  plot_trend = TRUE) + 
                  facet_wrap( ~ feature_label, scales= "free_y")

Analyzing Branches in Single-Cell Trajectories

通常，细胞的发育轨迹会存在不同的分支，出现分支是因为细胞执行其他不同的功能。当细胞做出命运选择时，其发育轨迹中就会出现分支：其中，一个发育世系沿着一条路径前进，而另一个世系沿着第二条路径前进。Monocle2提供了一种特殊的统计检验方法：branched expression analysis modeling（BEAM），可以对不同的分支事件进行分析。

lung <- load_lung()
plot_cell_trajectory(lung, color_by = "Time")

BEAM方法接受一个已通过orderCells函数排序的CellDataSet以及发育轨迹中分支点的名称作为输入，返回每个基因的显着性得分表。得分显着的基因在其表达中被认为是分支依赖性的。

# 使用BEAM函数进行分支表达建模分析
BEAM_res <- BEAM(lung, branch_point = 1, cores = 1)
BEAM_res <- BEAM_res[order(BEAM_res$qval),]
BEAM_res <- BEAM_res[,c("gene_short_name", "pval", "qval")]

我们可以使用plot_genes_branched_heatmap函数绘制特殊类型的热图，可视化所有明显依赖于分支的基因的表达水平的变化。此热图同时显示了两个谱系中基因表达水平的变化，它还要求选择要检查的分支点。其中，列是伪时间中的点，行是基因，伪时间的起始点位于热图的中间。这些基因按层次结构聚类，可以可视化具有相似谱系依赖性表达模式的基因模块。

plot_genes_branched_heatmap(lung[row.names(subset(BEAM_res,
                                          qval < 1e-4)),],
                                          branch_point = 1,
                                          num_clusters = 4,
                                          cores = 1,
                                          use_gene_short_name = T,
                                          show_rownames = T)

lung_genes <- row.names(subset(fData(lung),
                        gene_short_name %in% c("Ccnd2", "Sftpb", "Pdpn")))

plot_genes_branched_pseudotime(lung[lung_genes,],
                               branch_point = 1,
                               color_by = "Time",
                               ncol = 1)

参考来源：http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/