Seurat包学习笔记（八）：Cell-Cycle Scoring and Regression

在本教程中，我们将学习如何通过一些经典的marker基因计算细胞周期阶段评分，并在预处理过程中将其从scRNA-seq数据中进行回归处理，来减轻细胞周期异质性对下游数据分析的影响。

加载所需的R包和数据

library(Seurat)

# Read in the expression matrix The first row is a header row, the first column is rownames
exp.mat <- read.table(file = "../data/nestorawa_forcellcycle_expressionMatrix.txt", header = TRUE, 
    as.is = TRUE, row.names = 1)

# A list of cell cycle markers, from Tirosh et al, 2015, is loaded with Seurat.  We can segregate this list into markers of G2/M phase and markers of S phase
# 查看细胞周期marker基因
cc.genes
$s.genes
 [1] "MCM5"     "PCNA"     "TYMS"     "FEN1"     "MCM2"     "MCM4"     "RRM1"    
 [8] "UNG"      "GINS2"    "MCM6"     "CDCA7"    "DTL"      "PRIM1"    "UHRF1"   
[15] "MLF1IP"   "HELLS"    "RFC2"     "RPA2"     "NASP"     "RAD51AP1" "GMNN"    
[22] "WDR76"    "SLBP"     "CCNE2"    "UBR7"     "POLD3"    "MSH2"     "ATAD2"   
[29] "RAD51"    "RRM2"     "CDC45"    "CDC6"     "EXO1"     "TIPIN"    "DSCC1"   
[36] "BLM"      "CASP8AP2" "USP1"     "CLSPN"    "POLA1"    "CHAF1B"   "BRIP1"   
[43] "E2F8"    

$g2m.genes
 [1] "HMGB2"   "CDK1"    "NUSAP1"  "UBE2C"   "BIRC5"   "TPX2"    "TOP2A"  
 [8] "NDC80"   "CKS2"    "NUF2"    "CKS1B"   "MKI67"   "TMPO"    "CENPF"  
[15] "TACC3"   "FAM64A"  "SMC4"    "CCNB2"   "CKAP2L"  "CKAP2"   "AURKB"  
[22] "BUB1"    "KIF11"   "ANP32E"  "TUBB4B"  "GTSE1"   "KIF20B"  "HJURP"  
[29] "CDCA3"   "HN1"     "CDC20"   "TTK"     "CDC25C"  "KIF2C"   "RANGAP1"
[36] "NCAPD2"  "DLGAP5"  "CDCA2"   "CDCA8"   "ECT2"    "KIF23"   "HMMR"   
[43] "AURKA"   "PSRC1"   "ANLN"    "LBR"     "CKAP5"   "CENPE"   "CTCF"   
[50] "NEK2"    "G2E3"    "GAS2L3"  "CBX5"    "CENPA"  
# 获取S期marker基因
s.genes <- cc.genes$s.genes
# 获取G2M期marker基因
g2m.genes <- cc.genes$g2m.genes

构建Seurat对象并进行数据预处理

# Create our Seurat object and complete the initalization steps
marrow <- CreateSeuratObject(counts = exp.mat)
marrow <- NormalizeData(marrow)
marrow <- FindVariableFeatures(marrow, selection.method = "vst")
marrow <- ScaleData(marrow, features = rownames(marrow))

PCA降维可视化

我们使用FindVariableFeatures函数筛选出的高变异基因进行PCA降维可视化，可以发现尽管大多数变异都能被解释，但是在PC8和PC10中存在一些细胞周期基因，如TOP2A和MKI67。因此，我们试图通过回归处理减少细胞周期异质性对下游分析的影响。

marrow <- RunPCA(marrow, features = VariableFeatures(marrow), ndims.print = 6:10, nfeatures.print = 10)
## PC_ 6 
## Positive:  SELL, ARL6IP1, CCL9, CD34, ADGRL4, BPIFC, NUSAP1, FAM64A, CD244, C030034L19RIK 
## Negative:  LY6C2, AA467197, CYBB, MGST2, ITGB2, PF4, CD74, ATP1B1, GP1BB, TREM3 
## PC_ 7 
## Positive:  HDC, CPA3, PGLYRP1, MS4A3, NKG7, UBE2C, CCNB1, NUSAP1, PLK1, FUT8 
## Negative:  F13A1, LY86, CFP, IRF8, CSF1R, TIFAB, IFI209, CCR2, TNS4, MS4A6C 
## PC_ 8 
## Positive:  NUSAP1, UBE2C, KIF23, PLK1, CENPF, FAM64A, CCNB1, H2AFX, ID2, CDC20 
## Negative:  WFDC17, SLC35D3, ADGRL4, VLDLR, CD33, H2AFY, P2RY14, IFI206, CCL9, CD34 
## PC_ 9 
## Positive:  IGKC, JCHAIN, LY6D, MZB1, CD74, IGLC2, FCRLA, IGKV4-50, IGHM, IGHV9-1 
## Negative:  SLC2A6, HBA-A1, HBA-A2, IGHV8-7, FCER1G, F13A1, HBB-BS, PLD4, HBB-BT, IGFBP4 
## PC_ 10 
## Positive:  CTSW, XKRX, PRR5L, RORA, MBOAT4, A630014C17RIK, ZFP105, COL9A3, CLEC2I, TRAT1 
## Negative:  H2AFX, FAM64A, ZFP383, NUSAP1, CDC25B, CENPF, GBP10, TOP2A, GBP6, GFRA1
DimHeatmap(marrow, dims = c(8, 10))

计算细胞周期评分

首先，我们基于G2/M和S期的经典marker基因的表达，计算每个细胞可能所处的细胞周期的分数。这些marker基因集应该与它们的表达水平是成反相关的关系，而那些都不表达这些marker基因的细胞可能处于G1期。
我们使用CellCycleScoring函数计算每个细胞的细胞周期得分，并将计算出的S期和G2/M期的评分保存在metadata中，以及细胞处于G2M，S或G1期的预测分类。通过设置set.ident = TRUE，则CellCycleScoring将Seurat对象中每个细胞的分组信息设置为其所处的细胞周期阶段。

# 使用CellCycleScoring函数计算细胞周期评分
marrow <- CellCycleScoring(marrow, s.features = s.genes, g2m.features = g2m.genes, set.ident = TRUE)

# view cell cycle scores and phase assignments
head(marrow[[]])
orig.ident    nCount_RNA  nFeature_RNA    S.Score G2M.Score   Phase   old.ident
Prog_013    Prog    2563089 10211   -0.1424869  -0.4680395  G1  Prog
Prog_019    Prog    3030620 9991    -0.1691579  0.5851766   G2M Prog
Prog_031    Prog    1293487 10192   -0.3462704  -0.3971879  G1  Prog
Prog_037    Prog    1357987 9599    -0.4427021  0.6820229   G2M Prog
Prog_008    Prog    4079891 10540   0.5585405   0.1284359   S   Prog
Prog_014    Prog    2569783 10788   0.0711622   0.3166073   G2M Prog

# Visualize the distribution of cell cycle markers across
RidgePlot(marrow, features = c("PCNA", "TOP2A", "MCM6", "MKI67"), ncol = 2)

# Running a PCA on cell cycle genes reveals, unsurprisingly, that cells separate entirely by phase
marrow <- RunPCA(marrow, features = c(s.genes, g2m.genes))
# 数据可视化，可以看到细胞按不同的细胞周期进行了分群
DimPlot(marrow)

在数据标准化时消除细胞周期的影响

For each gene, Seurat models the relationship between gene expression and the S and G2M cell cycle scores. The scaled residuals of this model represent a ‘corrected’ expression matrix, that can be used downstream for dimensional reduction.
使用ScaleData函数进行数据标准化，并设置vars.to.regress参数指定对细胞周期评分进行回归处理，消除细胞周期异质性的影响

marrow <- ScaleData(marrow, vars.to.regress = c("S.Score", "G2M.Score"), features = rownames(marrow))

# Now, a PCA on the variable genes no longer returns components associated with cell cycle
marrow <- RunPCA(marrow, features = VariableFeatures(marrow), nfeatures.print = 10)
## PC_ 1 
## Positive:  BLVRB, CAR2, KLF1, AQP1, CES2G, ERMAP, CAR1, FAM132A, RHD, SPHK1 
## Negative:  TMSB4X, H2AFY, CORO1A, PLAC8, EMB, MPO, PRTN3, CD34, LCP1, BC035044 
## PC_ 2 
## Positive:  ANGPT1, ADGRG1, MEIS1, ITGA2B, MPL, DAPP1, APOE, RAB37, GATA2, F2R 
## Negative:  LY6C2, ELANE, HP, IGSF6, ANXA3, CTSG, CLEC12A, TIFAB, SLPI, ALAS1 
## PC_ 3 
## Positive:  APOE, GATA2, NKG7, MUC13, MS4A3, RAB44, HDC, CPA3, FCGR3, TUBA8 
## Negative:  FLT3, DNTT, LSP1, WFDC17, MYL10, GIMAP6, LAX1, GPR171, TBXA2R, SATB1 
## PC_ 4 
## Positive:  CSRP3, ST8SIA6, DNTT, MPEG1, SCIN, LGALS1, CMAH, RGL1, APOE, MFSD2B 
## Negative:  PROCR, MPL, HLF, MMRN1, SERPINA3G, ESAM, GSTM1, D630039A03RIK, MYL10, LY6A 
## PC_ 5 
## Positive:  PF4, GP1BB, SDPR, F2RL2, RAB27B, SLC14A1, TREML1, PBX1, F2R, TUBA8 
## Negative:  CPA3, LMO4, IKZF2, IFITM1, FUT8, MS4A2, SIGLECF, CSRP3, HDC, RAB44
# When running a PCA on only cell cycle genes, cells no longer separate by cell-cycle phase
marrow <- RunPCA(marrow, features = c(s.genes, g2m.genes))
DimPlot(marrow)

可选择的替代方法

在上述的分析过程中，我们消除了与细胞周期相关的所有信号。但是，在某些情况下，我们发现这会对下游的分析产生一定的负面影响，尤其是在细胞分化过程中（如鼠类造血过程）。在此过程中干细胞处于静止状态，而分化的细胞正在增殖。在这种情况下，清除所有细胞周期效应也会使干细胞和祖细胞之间的区别模糊。
作为替代方案，我们建议逐步消除G2M和S期评分之间的差异。这意味着将保持非周期细胞和周期细胞的组分差异，但是增殖细胞之间的细胞周期阶段的差异将从数据中去除。

# 计算分数差异
marrow$CC.Difference <- marrow$S.Score - marrow$G2M.Score
# 数据标准化消除分数差异
marrow <- ScaleData(marrow, vars.to.regress = "CC.Difference", features = rownames(marrow))

# cell cycle effects strongly mitigated in PCA
marrow <- RunPCA(marrow, features = VariableFeatures(marrow), nfeatures.print = 10)
## PC_ 1 
## Positive:  BLVRB, KLF1, ERMAP, FAM132A, CAR2, RHD, CES2G, SPHK1, AQP1, SLC38A5 
## Negative:  TMSB4X, CORO1A, PLAC8, H2AFY, LAPTM5, CD34, LCP1, TMEM176B, IGFBP4, EMB 
## PC_ 2 
## Positive:  APOE, GATA2, RAB37, ANGPT1, ADGRG1, MEIS1, MPL, F2R, PDZK1IP1, DAPP1 
## Negative:  CTSG, ELANE, LY6C2, HP, CLEC12A, ANXA3, IGSF6, TIFAB, SLPI, MPO 
## PC_ 3 
## Positive:  APOE, GATA2, NKG7, MUC13, ITGA2B, TUBA8, CPA3, RAB44, SLC18A2, CD9 
## Negative:  DNTT, FLT3, WFDC17, LSP1, MYL10, LAX1, GIMAP6, IGHM, CD24A, MN1 
## PC_ 4 
## Positive:  CSRP3, ST8SIA6, SCIN, LGALS1, APOE, ITGB7, MFSD2B, RGL1, DNTT, IGHV1-23 
## Negative:  MPL, MMRN1, PROCR, HLF, SERPINA3G, ESAM, PTGS1, D630039A03RIK, NDN, PPIC 
## PC_ 5 
## Positive:  GP1BB, PF4, SDPR, F2RL2, TREML1, RAB27B, SLC14A1, PBX1, PLEK, TUBA8 
## Negative:  HDC, LMO4, CSRP3, IFITM1, FCGR3, HLF, CPA3, PROCR, PGLYRP1, IKZF2

# when running a PCA on cell cycle genes, actively proliferating cells remain distinct from G1 cells however, within actively proliferating cells, G2M and S phase cells group together
marrow <- RunPCA(marrow, features = c(s.genes, g2m.genes))
DimPlot(marrow)

参考来源：https://satijalab.org/seurat/v3.1/cell_cycle_vignette.html