大家好,又回到了我们的生信入门专题,今天小编为各位整理了从一代到三代测序技术的原理,并介绍了生信常见的数据格式和格式转换的方法,希望大家能学有所得。
生信入门专题往期精彩:
1. Linux常用命令集
第一代测序技术
1977年Sanger等发明双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法。
Sanger测序原理
由于ddNTP的2’和3’都不含羟基,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP,得到片段大小不一致的DNA混合物,然后通过凝胶电泳分离和放射自显影后识别确定待测分子的DNA序列。
特点:读长长(1000 bp),准确性高(99.999%),通量低。
第二代测序技术
随着科学的发展,传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要,对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序,都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术,第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。
代表有Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和Life technologies(ABI)公司的SOLiD技术;Life technologies公司的Ion Torrent和Ion Proton技术等,经过不断的竞争,454、SOLiD 和Helicos平台不再开发新的仪器,Illumina平台最终成为市场主流,其方法为边合成边测序。
边合成边测序(Sequencing by Synthesis,SBS)
在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。
操作流程:
1.DNA文库构建
将基因组DNA随机片段化,然后通过末端修复、磷酸化、加A等步骤修补成平末端,最后加上特定的接头(Adaptor),构建成DNA文库。
2.簇的生成——桥式PCR
测序芯片实物图
(Flowcell :流动池,就是一张芯片,如Hiseq2500有2张flowcell,即一次运行的测序量;Lane:每张flowcell上通常都有多个通道,每个通道可以单独测不同的样品。)
Flowcel上面连有两种接头(P5、P7),当DNA经变性后流经Flowcell时,利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。DNA进行桥式PCR扩增,从而将碱基信号放大。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
3.测序
4.数据产出
特点:通量高、时间短、读长短。
第三代测序技术
即单分子实时DNA测序。DNA测序时,不需要经过PCR扩增,实现了对每一条DNA分子的单独测序,凭借超长的读长和可直接检测表观修饰等特点使其成为市场的新宠。目前以Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为主流。
单分子测序技术原理
SMRT技术:
也采用边合成边测序方法,以SMRT芯片为测序载体,芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记4种碱基(dATP,dTTP,dCTP,dGTP),在碱基配对阶段,加入不同碱基会发出不同的光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。另外,若碱基存在修饰,则通过聚合酶的速度会减慢,因此可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间、两峰之间的距离来检测甲基化等碱基修饰情况。SMRT测序速度快(每秒约数个dNTP),但是,测序错误率也较高(达到15%,可通过多次测序进行有效的纠错)。
特点:无需PCR扩增,读长长,无视GC含量的影响
纳米孔单分子测序技术:
纳米孔测序理论自1989年被提出以来,历经近三十年的发展,终于从理论到商业化并得到越来越广泛地应用。该技术的原理是当在膜两侧施加电压,分子马达驱动DNA分子通过纳米孔,导致电荷发生变化,每种碱基引起的电流变化是不同的,通过检测这些电流进而转化为对应的碱基序列。
2017年国际顶级期刊《Nature》上发表了题为“DNA sequencing at 40: past, present and future”的综述文章(doi:10.1038/nature24286),用以纪念DNA测序四十周年,讲述了DNA测序技术的发展历程、当前应用和未来的发展。感兴趣的小伙伴可自行下载阅读。
常用数据格式介绍
DNA序列表征
A =腺嘌呤
C =胞嘧啶
G =鸟嘌呤
T =胸腺嘧啶
U =尿嘧啶
R = GA(嘌呤)
Y = TC(嘧啶)
K = GT(酮)
M = AC(氨基)
S = GC
W = AT
B = GTC
D = GAT
H = ACT
V = GCA
N = AGCT(任何)
Fastq格式:一种基于文本的,保存生物序列(通常是核酸序列)和其测序质量信息的标准格式,一般都包含有4行。
第一行:由‘@’开始,后面跟着序列ID和可选的描述,序列ID是唯一的;
第二行:碱基序列;
第三行:由‘+’开始,后面是序列的描述信息;
第四行:第二行序列的质量评价(quality value)。
举例:
@HISEQ:777:HCMCVBCX2:1:1101:4712:2186 1:N:0:TACTCCAG
HISEQ:仪器 ID
777:Run ID
HCMCVBCX2:FlowCell ID
1:The lane number
1101:流通池道内的tile号码
4712:瓦片中的集群的‘x'坐标
2186:瓦片中的集群的’y'坐标
1:成对的成员,1或2(配对结束或配对读取)
N:如果读取过滤,则为Y;否则为N
0:当没有控制位开启时为0,否则为偶数
TACTCCAG:索引序列
Fasta格式:
1:以“>”为开头,fasta格式标志。
2:序列ID号,gi号,NCBI数据库的标识符,具有唯一性。
格式为:gi|gi号|来源标志|序列标志(接收号、名称等),若某项缺失可以留空,“|”保留。
3:序列描述。
4:碱基序列,序列中允许空格、换行、空行,一般一行60个。
Fastq文件→Fasta文件
Linux命令
法1:sed '/^@/!d;s//>/;N' your.fastq > your.fasta
法2:seqtk seq -A input.fastq > output.fasta
FASTX-Toolkit
•一款用于处理Short-Reads FASTA/FASTQ文件的程序,里面包含了丰富的Fasta/Fastq文件格式转换、统计等命令。
http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/
GenBank格式
以LOCUS和一些注释行开始。
序列的开头以“ORIGIN”标记,末尾以“//”标记。
EMBL格式
以标识符行(ID)开头,后面跟着更多注释行。
序列的开头以“SQ”开头标记,序末尾以“//”标记。
表 1 GenBank & EMBL数据库格式的对比
EMBL → Fasta格式转换(在线工具):
http://www.geneinfinity.org/sms/sms_embltofasta.html
另外给大家介绍一个常见测序文件格式解析的网站:
https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format1
该网站包含了各种各样的测序文件格式说明,想了解文件格式各行各列的含义直接找它即可!点击下方“阅读全文”即可进入。
文案|张家常
编辑|吴子环、姚晓韵
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