【现学现卖】实验-PCR

PCR（polymerase chain reaction），聚合酶链式反应，原理非常简单，含有3’羟基引物与模板链匹配，在DNA聚合酶作用下开始链的延伸。首先双链模板在合适的缓冲液中加热至100℃，变性为单链；快速冷却到引物-模板的退火温度（annealing temperature，Tm），由于引物一般比模板链短得多，所以动力学上活跃的多，退火温度下会比模板原始对应链先一步结合到模板链上；聚合酶在引物结合的地方开始工作，延伸链。

理想的PCR反应的40个热循环将使单一模板DNA分子产生约10^12个扩增子，足以使它从看不见的靶标成为荧光染色的可见产物。

PCR技术中最核心的是耐热性DNA聚合酶，它们主要衍生自细菌DNA聚合酶，最初从极端生命中鉴定出来，如生活在沸腾的热泉中，深海火山出口内的微生物等。如今当然没有人怀疑研究这些微生物的重要性，关键的发现也会来自较少被关注的领域。

简单介绍一下几种常提到的PCR（字母顺序）。

Colony PCR

在蓝白斑筛选时常用到的菌落PCR，用灭菌的牙签挑细菌菌落，放入PCR混合物中，充分混合一般就可以了。标准的做法是将菌落和Mix的混合液在99℃下处理2-5min，离心，取上清1-2μl加入新的Mix中进行PCR反应。但是一般直接反应，就可以扩增出来条带。

Degenerate PCR

当研究是从蛋白质出发时，常会用到简并PCR。我们已知蛋白质的氨基酸序列，但是由于密码子的简并性，无法得知准确的DNA序列，这时候就要设计简并PCR引物，可以在扩增过程中保证引物与模板可以配对。而这种PCR就是Degenerate PCR。

Error Prone PCR

这种PCR的目的就是为了产生随机突变，用于后续各种目的的研究。正常PCR中用到的DNA聚合酶有聚合和纠错的两种功能。在这种PCR中，采用的聚合酶没有纠错的功能。那么扩增会产生随机突变文库。

Hot start PCR

减少因为引物结合在错误的位点而导致的非特异性扩增。首先PCR反应混合物在不加入聚合酶的情况下，95℃加热2min，然后再加入聚合酶，开始反应。这里面常用的是Eubacterial typeⅠ DNA polymerase，Pfu，它在室温下活性很低，要温度大于70℃才有较好的活性。

Inverse PCR

用于扩增一段已知序列两侧的未知序列的方法。一段线性的序列，中间的一段是已知的。目前我们PCR都是已知两端，设计引物，扩增中间部分。现在变成了两端未知，那么首先将线性序列自身连接（self ligate），然后再用限制性内切酶处理已知的序列，环状被剪成了线状，同时曾经中间的已知序列也变成了两侧的，可以设计引物，进行正常的PCR扩增。

https://www.thermofisher.com/it/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-methods.html

Long PCR

一般PCR扩增的都是1000bp以内或者左右的序列，这个一般扩增5kb，甚至大于10bk长度的序列。用于长序列的克隆，但是效率低，要求反应有更高的准确度，一般采用Pfu酶。

Multiplex PCR

需要多对引物，在一个反应里，扩增不同的目的序列，当然最好相似度低一些的，不然很难设计引物区分。

Nested PCR

同样为了非特异性扩增。这种PCR需要设计两对引物。第一对引物可以扩增包含了目的基因的较长的一段序列，产物再次用第二对引物扩增，第二对引物扩增区域被包含在第一对引物之间。因为引物有结合在错误位点的可能，所以两种引物大大的降低了这种概率。设计两对引物以达到扩增目的基因的方法还可以用于其他的情况中，以增加扩增效率。

Quantitative Real-time PCR （qPCR）

是一种实时检测的荧光定量PCR，非常灵敏。在PCR反应体系中加入荧光基团，通过检测荧光化学物质检测链式反应，和反应总量，实现了实时；

通过加入内参或外参或绘制标准曲线可知模板中DNA的量，实现了定量（绝对定量/相对定量）。

常用的荧光方法：

①SYBR Green法，加入该燃料，可以结合在双链DNA的小沟，并释放荧光。它的使用很方便，但是不是特异性的。

②TagMan probe，探针可特异性与模板DNA互补配对，这时探针上的Repoter基团发射的荧光信号一直被Quencher基团吸收。而当PCR进行时，Tag酶外切活性将探针降解，Repoter基团释放荧光信号。这种探针的优点是特异性强，可与Multiplex PCR联用。

③Molecular Beacon probe，与前一个探针类似，都是拥有Reporter基团Quencher基团，增加反应特异性，可以与Multiplex PCR联用。与TagMan结合目的片段不同的是，molecular beacon probe通过Blocker结合在PCR反应的特异性引物上，当反应开始，Tag酶外切，使之释放荧光。大体与前一个探针类似。

qPCR中最重要的概念就是cycle threshold(Ct值-循环阈值)了，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techqpcr/

Reverse Transcriptase PCR（RT-PCR）

扩增RNA序列，首先将RNA逆转录为DNA（合成cDNA第一链和第二条），后续进行正常的PCR扩增。简写为RT-PCR，注意不要和实时PCR搞混。

Touch down PCR

一般用于从较杂的模板中扩增目的片段，避免扩增非特异性片段，提高准确度。利用的原理是退火温度升高，引物特异性提高，引物结合难度提高，扩增效率降低。首先PCR中前几个循环的退火温度较高，保证扩增的严谨正确，然后降低温度，提高效率。要注意的是，这个方法不能根本解决扩增效率低的问题。